骨移植理論與骨生長因子

一、骨移植

    移植骨可發揮3種生理作用：（1）誘導成骨作用，即通過募集具有成骨潛能的細胞在局部誘導新骨形成。（2）骨傳導作用，指移植骨作為支架引導來自受骨床的新生毛細血管、血管周圍組織和骨原細胞長入移植骨，繼之新骨沉積于其表面及周圍。（3）移植骨是骨形成細胞的來源，特別是新鮮自體骨。各種植骨方法在不同程度上體現了其中一種或數種作用。骨移植依其材料來源可分為自體骨、同種異體骨、異種骨和人工骨。自體骨因兼有骨誘導活性和骨傳導作用，且攜有具成骨作用之骨髓細胞，成骨效果最好，故目前仍奉為“金標準”。但自體骨來源有限，且取骨增加患者痛苦，尤不適用于兒童和老人。同種異體骨來源也有限，如檢疫不嚴還有傳播肝炎和艾滋病的危險。異種骨移植近年受到重視，如有報道Kiel骨復合自體紅骨髓移植取得滿意效果，國內研制的重組合異種骨為異種骨的臨床應用開辟了新的前景。人工骨特別是生物陶瓷類在骨科的應用受到矚目，但單純人工骨植入只能起支架作用，而并無誘導成骨活性。

1、自體骨移植
    臨床上自體骨多采自髂骨、脛骨和腓骨，分別提供松質骨、皮質骨和全骨。（1）非血管化自體移植骨因缺乏血供，大多數細胞死亡，僅表面0.1～0.3mm范圍的少數細胞依賴受區組織液的彌散得以存活。移植骨內的骨原細胞主要來自骨膜和骨髓，故松質骨之成骨能力大于皮質骨。松質骨血運重建較快，早期以成骨活動占優勢，死骨逐漸進行內部改建，被破骨細胞吸收，繼之新骨內有紅骨髓聚集，移植骨于是完全被新骨取代。松質骨常用于對移植骨強度無特殊要求時，可采取松質骨碎骨、全厚松質骨、髂骨外板和包括兩側骨皮質的髂嵴長條。常用的植骨方法有：外周薄片植骨、嵌入植骨、骨腔內充填骨和脊柱融合植骨術等。皮質骨血運重建較晚，早期有活躍的破骨活動，破骨活動和成骨活動交替進行，逐漸完成移植骨的修復。皮質骨適于提供功能性支持，脛骨、腓骨、股骨、橈骨和肋骨均可供骨，一般在脛骨內側面取骨。常用的植骨方法有單側上蓋植骨術、雙側上蓋植骨術、鋼板加單側上蓋植骨術、嵌入植骨術和骨釘植骨術。全骨移植骨通常取腓骨的中1/3段或上1/2段，用于修復兒童長骨如尺、橈骨缺損。（2）血管化自體移植骨因帶有自身的血供系統，不會發生骨壞死和吸收，只須與受區骨發生愈合，其修復過程類似新鮮骨折，無須經過爬行替代。移植骨血供可來自肌蒂或吻合血管。行帶肌蒂骨瓣移植時，保留移植骨的肌肉附著部及骨膜，移植骨通過肌蒂滋養血管或知名血管供血。常用的有股方肌蒂骨瓣、縫匠肌股直肌蒂骨瓣移植術、帶肌蒂腓骨段轉移術和帶肌蒂皮質骨片移植術。帶血管自體骨移植適用于受骨床瘢痕多、局部循環差或常規植骨不易愈合時。帶血管復合骨肌皮瓣移植可對皮膚、肌肉和骨復合缺損一次進行修復。常用方法有帶血管髂骨游離移植、帶血管腓骨游離移植和帶血管肋骨游離移植，所用血管須有足夠的長度和管徑，起源及位置較恒定。

2、同種異體骨移植
    與自體骨移植相比，同種骨材料來源較多，且因其具有天然結構、形狀和強度，有一定的誘導活性，在骨移植中有其不可替代的地位。但同種骨移植如檢疫不嚴有傳播肝炎、艾滋病等疾病的危險。此外據報道，對人工關節置換術中切除的1146個股骨頭進行病理檢查，發現91例除骨關節炎外還有其它病變，包括軟骨鈣質沉著、缺血性壞死、骨瘤、惡性腫瘤、骨代謝疾病和炎癥性關節炎，故建議凡進入骨庫的異體骨材料均須經過組織學檢查。

    同種骨特別是新鮮同種骨，常引起免疫排斥反應，導致移植骨吸收而失敗。此種免疫反應以活性淋巴細胞和細胞毒性抗體的產生為特征，細胞膜表面的糖蛋白是引起免疫反應的主要抗原成分，后者受主要組織相容性復合體（MHC）控制表達。受體對同種骨移植的免疫反應以細胞免疫為主，體液免疫不直接參與，但多數情況下受體循環中出現針對移植骨的特異性抗體。出現排異時干擾素和腫瘤壞死因子含量會增高，推測其在排異反應中可能起一定作用。為消除或減弱同種骨的抗原性，常采用各種物理、化學方法進行處理，常用且證明效果較好的方法有：（1）冷凍法：在-20～-196℃保存2w以上，可多少減弱其抗原性；（2）冷凍干燥法：冷凍至-85℃，在真空狀態使水分升華干燥，其抗原性低于冷凍骨，且可在室溫下長期保存；（3）脫鈣法：多行部分脫鈣處理，因其具有良好誘導成骨活性，并保有一定的機械強度。大段同種骨關節移植物可采用深低溫或冷凍干燥法保存，冷凍前須用10%甘油等冷凍保護劑浸洗，盡可能保存軟骨細胞。

    冷凍、凍干和脫鈣同種骨均已應用于臨床。主要用于骨腔充填、骨段移植術、關節融合術和假體重建術等方面。脫鈣骨經化學滅菌、提取抗原和自溶消化處理，消除了可溶性同種抗原，植入后骨形成比新鮮骨、凍干全骨或60鈷輻照滅菌的凍干骨更多。

3、異種骨移植
    動物骨來源廣，避免了自體骨取骨可能引起的并發癥，也無同種異體骨可能傳播人類疾病的危險。但未經處理的異種骨移植后必然引起排斥反應，導致手術失敗，是近百年來異種骨移植面臨的主要難題。參與異種骨移植免疫反應的因素，包括特異性細胞免疫和體液免疫。曾采用冷凍、凍干和脫鈣法處理異種骨，以消除其抗原性，均因效果不佳而不再使用。還曾使用各種脫蛋白骨，如Kiel骨、Oswestry骨和Bio-Oss骨，雖然抗原性極弱，但也喪失了誘導成骨活性而僅能起被動的骨傳導和保護性支架作用。經如此處理的異種骨多以復合形式應用，如將Kiel骨復合自體紅骨髓治療包括假關節、良性骨腫瘤和創傷性骨缺損等多種傷病和關節融合術，療效滿意。但自體紅骨髓來源有限，這種復合異種骨未能在臨床推廣應用。如何消除異種骨的抗原性同時保留其誘導成骨能力，是異種骨應用于臨床必須解決的問題。國內胡蘊玉等研制的“重組合異種骨”，突破了異種骨處理的傳統觀念，對異種骨的抗原性和誘導成骨活性分別進行處理，即從異種皮質骨中提取BMP，將異種松質骨制成無抗原載體，然后將二者重新組合。小牛松質骨載體經脫脂、部分脫蛋白、表面脫鈣和凍干等一系列處理，基本消除了抗原性，并保持了天然多孔結構，復合BMP后具有高效誘骨活性。小鼠肌袋模型實驗表明，僅含0.5mg BMP的重組合異種骨，異位植入14d即有骨組織形成，28d后誘導產生成熟的骨組織。將其植入15mm兔橈骨缺損，4w后有新生骨軟骨形成，16w缺損完全修復。臨床上重組合異種骨用于治療骨不連、骨缺損和難愈性骨折，療效好，移植骨多在2～6個月愈合，無明顯排斥反應。

4、人工骨
    許多人工骨材料已被應用于骨重建，復合有成骨潛能的細胞或生長因子后效果較好，但其植入后的長期可靠性是一個問題。人工骨材料須能滿足以下基本要求：（1）具有良好的生物相容性；（2）具有一定的機械穩定性；（3）有微孔結構，使新生骨組織得以長入；（4）其吸收速度與新骨生長速度大致保持同步；（5）易于加工成所需大小和形狀。生物陶瓷和可降解高分子生物材料是目前常用的兩大類人工骨材料。

    生物陶瓷作為植入物能滿足人工骨的一般要求，其優點是生物相容性好，缺點是機械性能較差，硬而脆，易斷裂。根據植入物與受體骨組織界面所發生組織反應的類型，可將生物陶瓷分為4型：（1）近乎惰性的晶體生物陶瓷：無生物活性，植入后與骨組織之間形成纖維膜，易松動脫落。臨床上得到廣泛應用的是氧化鋁，可用作人工髖關節假體部件。（2）多孔陶瓷：包括多孔多晶氧化鋁和羥基磷灰石（HA）涂層的金屬，其特點為呈生物惰性，但在骨組織長入其孔隙時卻形成高度迂曲的界面，從而提供了機械穩定性。（3）表面活性陶瓷：包括生物活性玻璃（bioglass）、玻璃陶瓷（glass-ceramics）和羥基磷灰石，其化學組成與人體骨組織相近，可借助化學鍵直接與骨結合，即具有生物活性。近年研制出一種稱為ceravital的玻璃陶瓷，與骨結合性能甚好，已成功地應用于脊柱外科和制造人工骨盆。HA陶瓷多與其它材料復合使用，如HA與自體骨、自體紅骨髓、膠原、BMP、同種異體骨（脫鈣骨基質或去抗原自溶脫鈣同種骨）、煅石膏、聚合物和氧化鋁陶瓷等復合，可克服HA缺乏骨誘導性和顆粒性材料成形困難的缺點。HA植入后不吸收。（4）可吸收的陶瓷：在宿主體內逐漸吸收而被形成的新骨替代，以磷酸三鈣（TCP）為其代表。TCP之生物學特性與HA大致相同，其優于HA之處為植入后在體內緩慢降解吸收。現多用TCP作為載體復合各種生物活性因子使用，如TCP復合BMP，可發揮骨傳導與骨誘導之雙重作用。

    可降解高分子生物材料生物相容性較好，可降解，且具有一定的機械強度，主要有聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA），植入體內可作為支架起骨傳導作用。但此二種材料降解后有酸性代謝產物積聚，特別是聚乳酸，可在體內形成無菌性竇道。利用此種材料較理想的降解速度，用以作為載體與具強誘導成骨能力的生長因子結合制成復合材料，比其它人工骨具有更多優點。

二、骨生長因子

    生長因子能促進細胞增殖、分化和細胞外基質合成，對骨折修復的啟動、發展、調控及改建起重要作用。鑒于此，應用生長因子試圖促進骨折愈合就是很自然的了，而生長因子動物實驗和臨床應用結果也表明，生長因子用于骨折延遲連接或骨不連的治療確有良好效果。雖然有許多生長因子參與調節骨折愈合，但目前只對少數幾種的作用有所了解，其中研究較多的是骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP)、β轉化生長因子（transforming growth factor β，TGF-β）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF)胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor,PDGF)。這幾種因子由炎癥細胞、成骨細胞和軟骨細胞合成，在骨折愈合的整個期間均有表達。

1. BMP

    由動物骨提取的天然BMP是幾種不同分子量蛋白質的混合物，其臨床應用在80年代末就有報道。Urist首先將BMP用于難愈性骨不連的治療。其后Johnson等將高度濃縮的人BMP（內含BMP-2、BMP-4和OP-1）復合非膠原蛋白和去抗原異體骨植入骨折部位，治療28例骨不連與骨缺損，其中26例（93%）一次治愈，2例經再次手術植入BMP也治愈。另一組47例脛骨和股骨不連接，植入天然BMP后均達到骨愈合。國內用天然牛BMP復合去抗原牛松質骨制成“重組合異種骨”，治療骨不連和骨缺損，效果也很好。天然BMP產量畢竟有限，應用重組DNA技術生產的BMP(如rhBMP)與天然提取物相比，具有產量大、純度高的優點，為廣泛應用于臨床提供了實際可能。現已從牛骨分離出7種BMP，并已用重組DNA技術表達了相應的人BMP，其中BMP-2和BMP-7(成骨蛋白-1,OP-1)研究較為透徹，已有關于臨床應用的報道。

    BMP-2：BMP-2參與骨髓中祖細胞向成骨細胞的分化，在離體條件下可誘導成骨細胞前體細胞向較為成熟的類成骨細胞分化，同時抑制其肌源性分化。復合脫鈣基質載體之rhBMP-2可在大鼠體內誘導骨形成，而在小鼠，植入無載體之rhBMP-2也導致骨形成。rhBMP-2可誘導結構性骨形成修復大鼠股骨節段性缺損，修復效果取決于劑量大小，而加入骨髓則可達到100%的愈合率。rhBMP-2復合膠原載體以外置植骨形式貼附于兔尺骨截骨部位，與單植入膠原載體及截骨后未予處理之對照相比，X線和生物力學測試均顯示植入rhBMP-2 后骨愈合明顯加快；3w后rhBMP-2組7/10有骨性橋接，而對照則無；4w后其抗扭強度相當于對照6w后之強度。羊股骨2.5cm節段性缺損植入復合膠原載體之rhBMP-2獲得大致相同的結果：1個月后即有新骨形成，4個月后去除內固定，此時斷端間已有骨性連接，骨礦質含量與正常股骨相仿，1年后新皮質骨形成和髓腔再通接近完成。組織學研究表明，繼軟骨內骨化之后，完全按正常順序發生塑形和改建，新骨形成完全是一個可以預測的過程。rhBMP-2用于脊椎融合術也取得良好效果：在狗外后側橫突融合模型，植入rhBMP-2后3個月即有堅固的大塊融合，而自體骨移植8個月后也僅有些微融合。目前有很多單位在進行用rhBMP-2治療骨折的臨床研究，但結果都是初步的。據來自美國4個大創傷中心的報道，12例用髓內釘或外固定器固定的II、IIIA和IIIB度開放性脛骨骨折植入復合膠原載體之3.4mg或6.8mg rhBMP-2，9例（75%）一次性治愈，3例需二次植骨。術后2例出現抗BMP-2之抗體。用rhBMP-2復合膠原載體修復牙槽嵴缺損，所誘導的新骨量（高度、寬度）與自體骨移植相仿，便于安裝義齒并承受功能載荷。rhBMP-2之安全性已通過檢定，美國食品與藥品管理局（FDA）批準rhBMP-2臨床試用治療脛骨骨折和骨缺血性壞死。

    BMP-7（OP-1）：OP-1可刺激成骨細胞系細胞增殖和分化。在成骨細胞原代培養中加入OP-1可增加堿性磷酸酶、I型膠原和骨鈣素合成，促進細胞外基質礦化。將復合膠原載體之rhOP-1植入大鼠皮下可引起一系列細胞反應，導致功能齊全的新骨形成。兔尺骨1.5cm缺損植入復合膠原載體之rhOP-1，8w后所有缺損均達到完全愈合；形成之新骨主要為板層骨，可見新生骨皮質和外觀正常的骨髓成分；生物力學測試表明，其平均抗扭強度與正常骨相仿。在靈長類（非洲綠猴）尺骨和脛骨缺損模型，植入rhOP-1后的骨愈合率和愈合質量甚至優于自體骨移植。術后2～3w，缺損中出現分散的鈣化組織島，以后融合并改建為外觀正常的骨橋接填充缺損；4～8w新骨改建基本完成；12w愈合的缺損顯示致密的板層骨和少量編織骨，新皮質改建完善，髓腔中含具有功能的骨髓成分。rhOP-1用于狗外后側脊椎融合模型，6w即產生穩定融合，融合塊有很好的抗扭轉穩定性，12w完全融合；而自體骨移植26w才發生完全融合，自體骨融合之抗扭強度在各個時點均不如OP-1。將rhOP-1涂布于人工假體表面，可在假體-骨界面間隙誘導大量新骨形成，加強金屬假體與骨組織之結合。

    關于rhOP-1的臨床應用陸續有報道，特別是用于治療棘手的脛骨骨折不連接，初步結果令人鼓舞。如一組122例124處脛骨骨折不連接，植入與牛膠原載體復合之OP-1或自體骨。初步結果表明，OP-1治療骨不連的效果與自體骨相仿，但兩種方法均未達到100%的治愈率。另一組97例脛骨骨折不連接，50例用OP-1治療，47例行自體骨移植，結果OP-1之成功率為62%（31/50），自體骨為66%（31/47），但自體骨組骨髓炎之發生率較高。

    生長因子為引起靶細胞的反應，需要有較長的作用時間，因此載體的選擇很重要，BMP尤其如此。載體起支架作用，為BMP提供機械支持，構建適當的釋放系統，避免生長因子的流失，也便于靶細胞附著。更重要的是，良好的載體可增強BMP的骨誘導作用。在小鼠肌袋實驗中，1～2mg BMP是誘導骨組織形成的最低劑量，但將本無誘導成骨效應的0.5mg BMP復合去抗原松質骨（殘留部分膠原基質）后，同樣能誘導軟骨和骨形成，并顯示正常的分化過程。

2. TGF-β

    使用外源性TGF-β的確可促進骨缺損修復。在兔顱骨缺損模型，給予外源性TGF-β促進了成骨細胞的征集和增殖，骨基質迅速沉積，骨改建正常進行；不給予TGF-β則缺損不能愈合。將TGF-β注入小鼠股骨骨膜下，可啟動骨及軟骨生成過程，骨膜下可見新生軟骨和骨組織，存在膜內成骨及軟骨內成骨兩種成骨方式。大鼠骨膜下注射TGF-β也產生類似結果，增生組織中軟骨/骨組織之比率與TGF-β劑量有關，較大劑量有利于軟骨形成，TGF-β2促使軟骨增生作用比TGF-β1強。天然人TGF-β可促進大鼠脛骨骨折的愈合，且呈劑量依賴關系，給予較大劑量（40ng）之TGF-β后，骨痂直徑及斷裂載荷均有增加。兔脛骨骨干截骨用鋼板固定后，植入一滲壓泵持續在骨折局部釋放TGF-β，結果骨痂體積及抗彎強度均顯著增加。狗橈骨缺損給予TGF-β（復合適當載體或通過滲壓泵）也獲得類似結果。一般來說，TGF-β促進骨愈合和再生的作用較BMP為弱，但因目前尚未做到TGF-β型別（TGF-β1～TGF-β5）選擇、給藥時間和釋放方法的優化，故難以定論。

3. FGF

    外源性bFGF可加速骨折愈合。在大鼠骨折模型中，給予外源性bFGF可刺激血管形成，骨痂體積和礦質含量增加，但如持續輸注，則將延遲骨化的啟動，提示bFGF在骨折修復的早期可能有刺激骨形成的作用。據推測，bFGF作用于骨誘導初期之一或數個環節，從征集炎癥細胞和干細胞開始，以軟骨形成告終，既然軟骨數量增加，誘導后期骨形成量隨之增加。將bFGF復合透明質酸酯注射于大鼠頂骨骨膜下，3d后骨膜顯著增厚，7d后骨膜內有編織骨形成，14d骨形成量顯著增加。在兔腓骨截骨模型，在骨折部位一次性注入復合透明質酸酯之bFGF（20～200ug），與對照相比，骨痂和新骨體積增加，成骨細胞數量和活性增加，骨的機械強度也有所提高，整個過程按骨折愈合之正常順序進行。應用復合載體之bFGF治療兔股骨10mm缺損，也可改善缺損之愈合情況。給大鼠靜注bFGF可刺激體內各部位骨骼成骨細胞增生和骨內膜新骨形成。已證明bFGF對成纖維細胞和前成骨細胞有強大促分裂作用，可增強細胞外基質的骨鈣蛋白基因表達，但對已分化的成骨細胞作用不大。bFGF的骨誘導作用與劑量大小有關。在大鼠脛骨骨折模型，植入8～200ng可增加骨鈣含量78%，而劑量增大至1900ng則反而抑制骨誘導，軟骨細胞密度和骨化指數均有所降低。劑量甚大時移植骨中無新骨組織長入，而是被大量纖維組織穿透，這可能是由于高濃度bFGF對成纖維細胞的作用較其對成骨細胞前體細胞作用更強。還有證據表明，過量bFGF之所以抑制骨形成，是由于抑制成骨細胞中I型膠原基因的表達。

    在離體條件下，bFGF抑制骨細胞分化和基質合成；但將bFGF注入體內則不僅顯著促進成骨性細胞的增生，而且增強其分化從而加速骨形成。其所以如此，是由于bFGF刺激了其它生長因子的分泌或增強其作用所致。有報道bFGF可增強成骨細胞中TGF-β的表達；bFGF在刺激骨內膜骨形成的同時增加骨內膜細胞中TGF-β的表達。可見，bFGF的作用至少部分是由TGF-β介導的。

    bFGF還是強大的毛細血管增殖刺激劑，促使毛細血管向創傷區長入，為組織的修復提供營養。將重組bFGF與部分純化的牛BMP懸液混合后注入小鼠肌肉，單獨注射BMP和bFGF作為對照。21d后牛BMP/bFGF組及單純牛BMP組均有新骨形成，但牛BMP/bFGF組鈣含量是單純牛BMP組的3倍，并有明顯的血管增生現象。其所以如此，是bFGF促進了BMP誘發的需要血供的軟骨內化骨。據此，應用含有血管增殖因子bFGF的骨誘導物，可能會促進某些血運不良的骨折愈合。

4. IGF

    IGF-I既有局部作用，也有全身作用，對大鼠全身給予IGF-I可促進其顴弓5mm缺損之愈合；手術造成8mm全厚顱頂骨缺損，通過皮下滲壓泵給予2mg IGF-I，14d后由缺損邊緣長出皮質骨修復缺損，說明IGF-I可促進膜內骨缺損之修復。IGF-II是骨內含量最高的生長因子之一，其生物學作用與IGF-I大致相同。雖然IGF-II與IGF受體之親和力較IGF-I為弱，對細胞的刺激作用也較弱，但因IGF-II在循環中之濃度較高，故可能對骨折愈合有一定作用。有報道外加磁場可刺激人成骨細胞樣細胞培養和大鼠骨痂培養產生IGF-II。有用IGF-I治療由生長激素受體缺陷引起的Laron侏儒癥的報道，尚未見用于骨折治療的臨床研究。

5. PDGF

    將PDGF注入小鼠顱頂骨上面可誘導新骨形成，還有促血管形成的作用。在兔脛骨截骨模型，一次注射PDGF增加了骨痂的密度和體積。組織學分析表明，截骨部位經PDGF處理后其成骨作用向前推進了一步，但生物力學測試并未顯示骨強度有所提高。PDGF固然可誘導新骨形成，但因其刺激前列腺素合成而增加骨吸收，限制了其修復骨折的用途。重組PDGF可加速嚙齒類傷口肉芽組織形成，臨床上局部用于褥瘡治療初見成效。

    綜上所述，骨折修復是一個復雜的過程，需要多種生長因子的參與和協調作用，如TGF-β就是FGF的調節物之一，bFGF與IGF也表現出協同作用。在骨折不連接的治療中，單用某一種生長因子可能效果不明顯，而聯合應用數種生長因子則可能會有顯效，上述并用BMP與bFGF異位成骨實驗中鈣含量增加和明顯血管增生就是明證。PDGF、IGF-I和TGF-β單用均可使離體大鼠胚胎顱頂骨之基質沉積增加，并用此諸生長因子時其刺激作用大為加強。對微型豬皮質骨缺損聯合應用PDGF和IGF-I顯著增加了骨痂礦化組織面積、周徑及其所占百分比，優于單用PDGF或IGF-I。另據報道，聯合應用BMP和PDGF或BMP和bFGF修復骨缺損，其新骨生成量及骨愈合率顯著增加。此外，將生長因子與蛋白酶抑制劑合用，因其阻止生長因子的降解，當可延長其作用時間從而提高治療效果。