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HPLC流動相的緩沖液 緩沖液流動相可以根據(jù)下面的操作步驟配制： 將緩沖液藥品溶解在水中制成緩沖液（溶液A）。 用pH計確定或調(diào)節(jié)溶液A的pH。 將一定體積（如200ml）的有機溶劑B與由步驟2配制的溶液A（如800ml）混合，制成最終流動相（此處的有機相為20%）。 檢查最終流動相的pH（此處為選項）。 由于測定含有有機調(diào)節(jié)劑的流動相pH計發(fā)生漂移，使其測定pH不很可靠，所以上面的步驟4 一般只有在考察誤差的主要來源時采用，大多數(shù)實驗室皆略去此步驟。 步驟1一般是將配制緩沖液所用的兩種試劑（A1和A2）分別按計算量先溶解在水中制成水溶 液，然后再將這兩種溶液按一定的比例混合得到預期pH的溶液A。若在此步驟2中調(diào)節(jié)pH，則可以采用溶劑A滴定溶劑B，也可反過來滴定，并通過pH計測量 得到所需pH的最終緩沖溶液。在大多數(shù)實驗室中，pH的測量精度通常不會達到±0.05—0.1個pH單位，這會顯著影響一些樣品的分離。當HPLC方法 對pH非常敏感時，步驟2只能大致確定pH值。 將準確稱重的緩沖液配制試劑與精確體積的脫氣蒸餾水混合，使其成為均一的溶液（不進一步調(diào)整pH），如此配得得緩沖溶液得pH可以控制在非常窄得范圍內(nèi)（±0.02單位），已知準確pH值得緩沖液濃溶液已有市售。 為了改善峰形或塔板數(shù)，有時在流動相中加入酸或堿（如三乙胺、乙酸等），如果這些添加劑并非為配制緩沖溶液時所采用得試劑，那么將這些試劑加入到流動相中后，還需重新滴加酸或堿，使流動相達到所需的pH值。 常用緩沖液的配制 當緩沖液被稀釋或濃縮時，pH也應(yīng)不變。其pH值應(yīng)近似恒定不變，或當其中的離解的陽離子（K+、Na+）或陰離子（Cl-、Br-）被其它種類的離子替 換時，表1—4中給出了響應(yīng)的配制方法，平衡陽離子為Na+，緩沖液的最終濃度為0.1mol/l，對于其它濃度的緩沖溶液或陽離子種類（通常K+）更 好，表中的數(shù)據(jù)也可供參考。較稀的或較濃的緩沖溶液，及包含有不同陽離子的溶液，其pH值會與表中的數(shù)據(jù)稍有出入。在方法建立過程中，精確的流動相pH值 往往并不重要，重要的是每次新配制的流動相的pH值與第一次基本相同（最好控制在±0.02范圍內(nèi)）。注意，只有當緩沖溶液的pH在緩沖試劑解離常數(shù) pKIa±1范圍內(nèi)時，緩沖溶液才具有有效的緩沖容量（如乙酸鹽的pKa=4.6，其適宜的pH范圍為3.6—5.6）。 表1 低pH值（25℃）磷酸鹽緩沖溶液的配制方法 溶液A1：0.1M磷酸。配制精確pH值緩沖液時，所用磷酸需滴定H3PO4的含量。 溶液A2：0.1M磷酸二氫鈉溶液，稱量13.8g NaH2PO4·H2O溶解于水中，定容于1L容量瓶中。 pH A1體積（ml） A2體積（ml） pH A1體積（ml） A2體積（ml） 2.0 565 435 2.8 175 825 2.2 455 545 3.0 110 890 2.4 345 655 3.2 55 945 2.6 250 750 表2 不同pH值（25℃）醋酸緩沖溶液的配制方法 溶液A1：0.1M醋酸溶液。6.0g（5.8ml）冰醋酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。 溶液A2：0.1M醋酸鈉溶液。8.2g C2H3O2Na（或13.6g C2H3O2Na·3H2O）溶解于水中定容到1L容量瓶中。 pH A1體積（ml） A2體積（ml） pH A1體積（ml） A2體積（ml） 3.6 926 74 4.8 400 600 3.8 880 120 5.0 296 704 4.0 820 180 5.2 210 790 4.2 736 264 5.4 176 824 4.4 610 390 5.6 96 904 4.6 510 490 表3 不同pH值（25℃）檸檬酸緩沖溶液的配制方法 溶液A1：0.1M檸檬酸溶液。21.0g 檸檬酸溶于水中，定容到1L容量瓶中。 溶液A2：0.1M檸檬酸鈉溶液。29.4g C6H5O7Na3·2H2O溶解于水中，定容到1L容量瓶中。 pH A1體積（ml） A2體積（ml） pH A1體積（ml） A2體積（ml） 3.0 930 70 5.2 360 660 3.2 870 126 5.4 320 680 3.4 810 190 5.6 270 726 3.6 750 260 5.8 230 764 3.8 700 300 6.0 190 810 4.0 660 340 6.2 140 856 4.2 610 370 6.4 60 940 4.4 560 440 6.6 40 960 4.6 510 490 6.8 30 970 4.8 460 540 7.0 10 985 5.0 410 590 表4 中等pH值（25℃）磷酸緩沖液的配制方法 溶液A1：0.1M磷酸二氫鈉溶液。13.8g NaH2PO4·H2O溶于水中，定容到1L容量瓶中。溶液A2：0.1M磷酸氫二鈉溶液。26.8g Na2HPO4·7H2O（或35.9g Na2HPO4·12H2O）溶于水中，定容到1L容量瓶中。 pH A1體積（ml） A2體積（ml） pH A1體積（ml） A2體積（ml） 5.6 948 52 7.0 390 610 5.8 920 80 7.2 280 720 6.0 877 123 7.4 190 810 6.2 815 185 7.6 130 870 6.4 735 265 7.8 85 915 6.6 685 315 8.0 53 947 6.8 510 490 表5和6給出了適于pH=7—10.6范圍的兩種有機堿緩沖液配制方法，這種有機堿緩沖液可以有效低減緩硅膠基柱的柱效降低。 表5 高pH（25℃）甘氨酸緩沖溶液的配制方法 溶液A1：0.2M甘氨酸。15.01g 甘氨酸溶于水中，定容于1L容量瓶中。 溶液A2：0.1M NaOH溶液，稀釋較濃的NaOH溶液。 pH A1體積（ml） A2體積（ml） pH A1體積（ml） A2體積（ml） 8.6 25 2.0 9.6 25 11.2 8.8 25 3.0 9.8 25 13.6 9.0 25 4.4 10.0 25 16.0 9.2 25 6.0 10.4 25 19.3 9.4 25 8.4 10.6 25 22.75 表6 高pH值（25℃）Tris緩沖溶液的配制方法 溶液A1：0.1M Tris（無堿），12.11g Tris溶于水中，定容到1L容量瓶中。 溶液A2：0.1M HCl溶液，稀釋較濃HCl溶液。 pH A1體積（ml） A2體積（ml） pH A1體積（ml） A2體積（ml） 7.1 50 45.7 8.1 50 26.2 7.2 50 44.7 8.2 50 22.9 7.3 50 43.4 8.3 50 19.9 7.4 50 42.0 8.4 50 17.2 7.5 50 40.3 8.5 50 14.7 7.6 50 38.5 8.6 50 12.4 7.7 50 36.5 8.7 50 10.3 7.8 50 34.5 8.8 50 8.5 7.9 50 32.0 8.9 50 7.0 8.0 50 29.2 |
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