儀器、原料和試劑
儀器
聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯免疫閱讀儀、洗板儀。
試劑及試劑配制
1. 抗原及酶標記抗體
①抗原： IgG
②酶標抗抗體：羊抗鼠IgG-HRP
2.包被液（CBS）：Na2CO3 0.8g，NaHCO3 1.46g，水溶解，定容500ml。
3. 封閉液（3％BSA+CBS 或5％牛奶+CBS）：含3％牛血清白蛋白（BSA）：10mL CBS中加入0.3g BSA。含5％荷蘭牛奶：10mL CBS中加入0.5g牛奶 。
4. 洗滌液（PBST 10*）：KH2PO4 4g，Na2HPO4·12H2O 58g，NaCl 160g， KCl 4g，Tween-20 10mL 加水定容2L。
5. 洗滌液(1*PBS)： PBST：H2O=1：9
6. 底物溶液（4甲基酰苯氨）
①TMB底物緩沖液(0.005mol/LPH3.6醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)：稱NaAc·3H2O：1.13g，C6H8O7·H2O ：1.05g，用蒸餾水溶解，定容至1000mL，調PH=3.6。
② TMB底物液：稱3,3＇,5,5＇-四甲基聯苯胺（TMB）0.08g 溶于40mL 二甲基亞砜（DMSO）中，加60 mL 甲醇，混勻，加100mL 底物緩沖液，在暗處避光攪拌2小時至溶解，4℃避光保存。
③H2O2 底物液：取140μL過氧化氫（H2O2）加入200mL底物緩沖液混勻。
④底物應用液：現用現配，TMB:H2O2=1:1混勻。
7. 終止液：2mol/L H2SO4
四、操作步驟
①抗原包被過夜（12h以上）： IgG抗原，用包被液（CBS）稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置過夜。
抗原用量：0.1μg*100N/抗原濃度 （N為板數）
②封閉：棄上清 加300μL/孔封閉液，37℃放置2h。
③洗滌：用洗滌液洗3次
④加一抗(待測樣品為細胞培養上清)：將含單克降抗體的細胞培養上清100μL /孔加到已包被的板上，空白培養基作為陰性對照，已知樣品血清（1：200稀釋于1%BSA+PBST中）作為陽性對照。37℃恒溫箱溫育2h。
測免疫效價待測樣品為小鼠血清時：采小鼠血液于常溫20min左右后放4℃至析出血清，3000r 10min離心。將含抗體的血清在已包被的板上用1%BSA+PBST連續倍比稀釋(按照1：200開始)，100μL /孔。每個樣品平行做兩份，小鼠陰性血清或空白培養基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。37℃恒溫箱溫育2h。
⑤洗滌：用洗滌液洗5次。
⑥加二抗（酶標抗抗體）：羊抗鼠IgG-HRP，用1%BSA+PBST l ：10000稀釋，100μL／孔， 37℃恒溫箱溫育1h。
⑦洗滌：用洗滌液洗5次，
⑧顯色：加新鮮配制的底物溶液(TMB:H2O2=1:1)100μL/孔，37℃恒溫箱放置10min，顯示藍色。
⑨終止反應、比色：加30μL/孔H2SO4終止液．顏色變黃；用酶標儀測定450nm 630nm處各孔的吸光值，陽性反應的最大稀釋度為待測樣品的效價。
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