微生物培養基的配制和滅菌

培養基是將微 生物生長繁殖所需要的各種營養物質，用人工方法配制而成的各種營養基質。培養基為微生物的生長提供營養物質和生存空間。它具有微生物正常生活所需的各種養料和適宜的環境條件；（1）適當組分和比例的營養物質；（2）適宜的pH值；（3）合適的滲透壓；（4）保持無菌狀態。所以培養基是培養微生物所必需的最主要材料。培養基的配制是微生物學工作者的主要技術操作之一。

培養基的種類：

根據培養基的組成成分，可將培養基分為三類：

合成培養基：由各種純化學物質按一定比例配制而成。

半合成培養基：由一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成。

天然培養基：利用天然來源的有機物配制而成的。

從培養基的物理狀態來分：

液體培養基：不加凝固劑的液態狀培養基。

固體培養基：在液體培養基中加入2％左右的凝固劑的固體狀培養基或固體狀農副產品培養基。

半固體培養基：在液體培養基中加入0.2％-0.5％凝固劑而成的半固體狀培養基。

微生物最常用的凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。它不是一種營養物質，只能被極少數種類的細菌分解利用。瓊脂是從海藻中（主要是石花菜）提取而制成的。是一種多糖類化合物，主要成分是復雜的多糖硫酸酯鈣鹽，瓊脂是一種可逆性膠體，在常規濃度下加熱到96C以上即成溶膠狀態，融化的瓊脂，當溫度下降到42℃以下，又凝固為固體。

l. 了解培養基的配制原理和方法，掌握其配制過程。

2. 了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。

3. 熟悉分離、培養微生物前的有關準備工作及操作方法。

1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、馬鈴薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等。

2. 高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細菌過濾器、紫外線殺菌燈。

3. 其它：天平、牛角匙、電爐、1N HCl、1N NaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠的三角瓶、帶棉塞的無菌試管、無棉塞的空試管、培養血、吸管、各種包裝紙防水紙、繩索、棉花、標簽等。

（一）、培養基配制

l. 培養基配制的一般方法和步驟

（1）稱量：按照培養基配方，正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。

（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根據實驗需要加入蒸餾水或自來水），用玻棒攪勻，加熱溶解。

（3）調pH值（調pH也可以在加瓊脂后再調），用1N NaOH或1N HCl調pH，用pH試紙對照。

表 6-1 瓊脂和明膠的特性比較

（4）加瓊脂溶化，在瓊脂溶化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養基溢出或燒焦，待完全溶化后，補足所失水分，一般數量少，時間短不必補水。

（5）分裝：在漏斗架上分裝。根據不同的需要進行分裝，一般制斜面的裝置為管高的1／5 特別注意不要使培養基粘污在管（瓶）口上以免浸濕棉塞，引起污染。

（6）包扎成捆、掛上標簽。培養基分裝好后，塞上棉塞，用防水紙包扎成捆掛上所配培養基名稱的標簽。

（7）滅菌備用。滅菌后如需制成斜面的，應在下磅后取出，擺成斜面（見圖6-1）。培養基經滅菌后，必須放在37℃恒溫培養箱中培養 24h，如確無菌生長、方可使用。

圖6-1 滅菌的試管培養基趁熱擺成斜面

2．三種培養基的配方及具體配制方法

（1）. 牛肉膏蛋白陳瓊脂培養基（用于分離和培養細菌，是一種天然培養基）。

配方：

本實驗將原配方配成各種濃縮液。各種濃度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨、30％氯化鈉。以配制200mL培養基為例。

吸取30％牛肉膏2mL；50％蛋白胨2mL；30％氯化鈉2mL；加入有刻度的搪瓷燒杯中，然后用自來水補足到200mL。用玻棒攪勻，在電爐上稍加熱，調 pH至 7.4，加瓊脂4g，加熱熔化，用玻棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解為止，趁熱在漏斗架上裝試管，（見圖6－2）。裝帶有棉塞的無菌試管，裝置1／5的試管高度共12支，作斜面培養基、用鋁殼試管帽的里裝10mL。約試管高度的 1／2以上，用作分離時倒平板用。

圖 6-2 分裝培養基圖 6-3 將培養基試管包扎成捆

分裝完畢，以12支為一捆，用防水紙包扎成捆（圖6-3），掛上標簽，滅菌備用。

（2）. 馬鈴薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）瓊脂培養基（用于分離和培養真菌之用，是一種半合成培養基）。

配方：

制備方法配制200mL培養基為例

取上皮馬鈴薯40g，切成小塊、放入無刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置電爐上加熱煮沸10min，用4層紗布過濾至具刻度的搪瓷杯中，濾液加水補足至200mL。然后加蔗糖4g，加瓊脂4g，加熱熔化并用玻棒不斷攪拌直至瓊脂完全溶化分裝試管，下面一系例步驟同配細菌培養基相同。

（3）. 淀粉瓊脂培養基（高氏一號Gause’I），用干分離和培養放線菌，是一種合成培養基。

配方：

制備方法配制（以配制200mL）培養基為例：

吸取配方液：1％KNO320mL；1％K2 HPO410mL；1％MgSO4·7H2 O10mL；l％NaCl10mL；1％FeSO4 7H2O0.02mL．加水補足至 200mL，置電爐上加熱.用另一只搪瓷杯稱取可溶性淀粉4g，從200mL中取出少量加入淀粉中，用玻棒調成糊狀，待液體沸騰后將淀粉糊洗入培養液中，攪勻，調pH至 7.4，加瓊脂 4g，加熱至瓊脂完全溶化為止，趁熱分裝試管，以下一系例步驟同于配制細菌培養基的操作方法。

3. 無菌水的制備

無菌水，為下一次微生物分離實驗中所需用而準備。

100mL三角瓶（裝有玻璃珠），裝自來水45mL，試管中裝9mL自來水，塞上棉塞，包扎滅菌備用。三角瓶和試管須預先塞好棉塞，并經干熱滅菌。

（二）分離培養微生物常用器皿的準備

1. 清洗一些玻璃儀器：如三角瓶試管，培養皿、吸管等。

2. 棉塞的制作：裝培養基和分離培養需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用為過濾空氣，使試管內外空氣可以流通，但外界空氣中雜菌不能進入，避免污染、試管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口約1-2mm處，用解剖針塞入少許棉花，（約1-1.5cm 長）以防止細菌吸入口中，井避免將口中細菌吹入管內。棉花要塞得松緊適宜。吹時以能通氣但不使棉花塞下滑為準。

教師示范做試管棉塞，同學每人做5支試管棉塞。棉塞要求不緊不松，兩頭光滑。試管棉塞的長度約3cm左右。塞入試管內部分約占2/3，頭部稍大約占1/3左右，見圖6-4。

圖6-4 試管棉塞的規范要求

1. 正確式樣2. 管內部分太短，管外部分太松3. 外部過小

4. 整個棉塞太松5. 管內部分過緊，外部太松

3. 包裝培養皿和吸管等。為了使培養皿、吸管、三角玻棒等洗凈，干熱滅菌后，不讓表面暴露，以保證無菌狀態，為此干熱滅菌前先用舊報紙包裝妥當（見示范），每組同學包培養皿6只（一包）。

吸管的包裝，將塞好棉花的吸管尖端，放在4~5cm寬的長紙條的一端，約成45°角左右，折疊紙條，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊，在桌面上向前搓轉，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結，準備滅菌，見圖6-5。

圖6－5吸管滅菌前用紙包卷示意圖

（三）培養基和玻璃器材的滅菌方法

滅菌的方法，通?？梢苑譃樗拇箢悾海?）加熱滅菌：包括直接灼燒滅菌、干熱滅菌、加壓蒸汽滅菌、間歇滅菌和煮沸消毒；（2）過濾去菌；（3）射線滅菌和消毒；（4）化學藥劑滅菌和消毒。

在本實驗中，介紹與培養基和玻璃器材滅菌有關的部份滅菌方法。

l. 干熱滅菌法（即熱空氣滅菌法）

干熱滅菌一般是利用電熱烘箱作為干熱滅菌器。前面所包裝好的玻璃器皿，如帶棉塞的三角瓶，試管、包裝好的吸管、培養皿等，放入電熱烘箱中。

打開烘箱頂部的通氣孔，接上電源加熱，使箱內空氣的溫度達到160℃~170℃，關閉通氣孔使箱內的溫度保持在160℃左右并維持1.5-2h。時間一到，切斷電源。待溫度下降60℃~70℃以下，方可打開箱門取滅菌物品，否則驟冷后易使箱內玻璃儀器破損。

2. 加壓蒸氣滅菌法

利用高壓滅菌器，使水的沸點在密閉的滅菌器內隨壓力升高而增高（見表6-2），來提高蒸汽的溫度和滅菌的效率。

在同一溫度下濕熱的殺菌效率比干熱大，因為微生物細胞蛋白質在濕熱情況下，易干凝固（見表6-3）。同時濕熱的穿透力強，當水蒸汽與被滅菌的物品相接觸后，便放出汽化潛熱，逐步提高被滅菌物品的溫度，直至與水蒸汽的溫度相等，達到平衡為止，從而提高滅菌效率。

表6－2 滅菌器內空氣比例與溫度之間的關系

表6－3 蛋白質含水量與凝固溫度之間的關系

手提式高壓滅菌鍋滅菌的操作步驟如下：

（1）在滅菌器內加入一定量的水（有的滅菌器內加水至止水線）。將用防水紙包扎好的滅菌物品如培養基、無菌水等，放進滅菌器內。

（2）接通電源，進行加熱。

（3）當壓力到達5bl/in2時，打開放氣閥，使鍋內的空氣和水蒸汽一同排出，直至壓力表的壓力恢復到零，然后關閉排氣閥，繼續加熱。

（4）當壓力表＊的壓力到達15bl/in2（即 1.05kg/cm2）時，此時滅菌器內的溫度達到121℃，維持30min不變。對熱不穩定的培養基滅菌時，應適當降低壓力，延長時間。

（5）滅菌時間一到，切斷電源，待壓力下降至零時，才能打開排氣孔，然后打開滅菌器蓋，取出物品。如果滅菌后的固體培養基要做成斜面，需趁熱放置。還需檢查培養基滅菌是否徹底。

3. 間歇滅菌法

常采用阿諾（Arnold）氏滅菌器和柯赫（Koch）氏滅菌器或蒸籠滅菌，常壓條件下蒸汽溫度不超過100℃。在沒有高壓滅菌器設備的情況下或不宜加壓滅菌的物品，可采用此法滅菌。

方法是：待滅菌物品放在滅菌器或蒸籠里，每d蒸煮1次，每次煮沸lh，連續3d重復進行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養基）放在37C恒溫條件下培養過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死的殘留芽孢萌發成營養體，以便下1次蒸煮時殺滅。

4. 過濾除菌法

一些不能加熱滅菌的液體物質（如維生素、血清），可以用過濾除菌法，一般用細菌過濾器進行除菌。（教師示范）

細菌過濾器中的過濾板常用陶瓷、硅藻土或石棉等做成，過濾板孔眼很小，細菌不能通過。因此，過濾后的液體就除去了細菌。在進行過濾除菌前，整個細菌過濾器和接受液體的器皿，必須要包裝妥當并進行加壓蒸汽滅菌后方可使用。

下面介紹石棉板濾器的構造及其操作方法。石棉板濾器又稱蔡氏（Scitz）濾器，它是由石棉制成的圓形濾板和一個特制漏斗組成（見圖6-6a）。此漏斗分上下兩節。上節為圓形金屬筒，下節為金屬漏斗。兩節由三個活動螺旋固定，便于裝卸。使用時拆開兩節，將濾板放在漏斗上的金屬篩板，再加上上節，然后將螺旋扭緊，將欲濾溶液置于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張無菌的新濾板。石棉板濾器因容積大小不同而有各種型號，石棉板也有不同規格型號使用時必須根據需要搭配妥當。圖6-6b為一個注射器裝備濾器，用于不便高壓蒸汽滅菌的維生素液或其他溶液的除菌和氣體的除菌，極為方便。

圖6－6 過濾除菌裝置a. 蔡氏過濾器b. 注射器濾器裝置

5. 紫外線滅菌

波長260~280nm之間的紫外線有很強的殺菌能力，一般紫外燈管能產生253.7nm的紫外光，殺死力強而穩定，但穿透力弱一般只適宜物體表面、空氣滅菌。例如接種室、培養室、手術室、藥廠包裝室等空氣滅菌。一般30w燈管、9m3空間，距地面2m每次打開紫外線照射0.5h，就使室內空氣滅菌。若照射紫外線時，先噴灑石碳酸等化學消毒劑，可增強滅菌效果。

在進行微生物接種和分離等操作時，常須用紫外線來殺滅接種室（箱）空氣、臺面等處的微生物。（參觀示范）

紫外線雖有較強的殺菌力，但穿透力較弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。

紫外線對眼粘膜及視神經有強烈的損傷作用，對皮膚有刺激作用，所以不能直接在紫外線燈開啟下工作和用眼睛直視開啟的紫外燈。

6. 化學藥劑消毒滅菌

微生物實驗室中常用的化學殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑，詳見表6-4。

表6－4 各類化學藥劑消毒滅菌的濃度、作用方式和用法

1、配固體培養基加瓊脂后加熱溶化時要注意哪些問題？

2、培養基中加瓊脂的作用是什么？

3、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場合有何不同？

4、如何檢查培養基滅菌是否徹底？