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一、貼壁細(xì)胞的消化 胰酶的質(zhì)量是影響干細(xì)胞的消化的關(guān)鍵因素之一，如果配的比較標(biāo)準(zhǔn)，消化的時(shí)候就容易消化，反之就不易消化。還要在你看到消化過(guò)頭的情況下，如果干細(xì)胞下來(lái)的比較多了，這時(shí)可以連同CMF或PBS加上營(yíng)養(yǎng)液一起傳。營(yíng)養(yǎng)液中有血清，胰酶遇到血清就會(huì)自動(dòng)終止消化，但這樣操作對(duì)干細(xì)胞是有一定的影響的。
對(duì)于容易消化的干細(xì)胞，加入PBS緩沖液洗去血清或加入胰酶，先中和血清的作用（30s），棄之，再加入適量胰酶作用10s-40s（根據(jù)細(xì)胞消化的難易程度），棄之，這樣依賴殘余的胰酶就可將干細(xì)胞消化單細(xì)胞。 在此介紹一種簡(jiǎn)單省事并且效果好、不損失干細(xì)胞的方法：倒掉舊培養(yǎng)液，加入少量胰酶沖洗一下，倒掉，再加入0.125-0.25%胰酶約6-10滴或1ml（25ml bottle）消化，再加入適量新培養(yǎng)基中和并分瓶。
這里，胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過(guò)度則對(duì)干細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分干細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則干細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷干細(xì)胞活性。 影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等）、消化時(shí)的溫度（氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。
2、離子螯合劑 0 P$ k7 t( f T1 v
離子螯合劑：不破壞細(xì)胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測(cè)干細(xì)胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。 1）、EDTA 用得也是非常多。一般濃度在0.02%左右。作用于細(xì)胞與間質(zhì)，對(duì)細(xì)胞間也有一定作用。注意，它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶。因此，配制時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)好酸堿度，它不能被中和。因此，消化下來(lái)的干細(xì)胞要洗一遍。 * j! \. H1 n1 k
2）、商品化的無(wú)酶消化液 有些消化酶液對(duì)干細(xì)胞的損傷比較大，但是分離成單細(xì)胞懸液的能力確實(shí)比較強(qiáng)。 對(duì)于較難消化的干細(xì)胞，可以用2%利多卡因消化5-8分鐘，然后再棄去，加培養(yǎng)基吹打。或者是棄去培養(yǎng)液后，用0.04%的EDTA沖洗一次，再用1/4v的0.04%的EDTA室溫孵育5min，棄去大部分EDTA，加入與剩余EDTA等量的胰酶（預(yù)熱）總體積1/10v。消化到有干細(xì)胞脫落。但大量使用EDTA對(duì)干細(xì)胞有損傷作用。也可以先用PBS把干細(xì)胞洗兩遍，使瓶?jī)?nèi)沒有血清了，減少對(duì)胰酶的中和，然后用新配的0.25%的胰酶加入3ml左右，放在37度，然后可以在少量干細(xì)胞消化下來(lái)時(shí)，拿著瓶口，運(yùn)用手腕的力量輕輕震蕩瓶?jī)?nèi)液體，這樣干細(xì)胞很快就下來(lái)了，還不需要吹打，分散也均勻。
3、物理法：直接吹打或用細(xì)胞刮子將干細(xì)胞刮下來(lái)。 6 G/ F2 E+ v: Q
6 D" h* y7 x5 N# H3 x* C 7 m1 M* e$ O+ o8 `5 b; o! M 4、冷凍法： 此方法僅能用于細(xì)胞傳代時(shí)無(wú)法使組織上的細(xì)胞脫落下來(lái)的情況。本方法的原理是因干細(xì)胞冷凍后收縮，從而從培養(yǎng)瓶上脫落下來(lái)。優(yōu)點(diǎn)是：對(duì)干細(xì)胞損傷小，不需要中止或洗干細(xì)胞，方便，不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的干細(xì)胞。不足是干細(xì)胞常成小片脫落。此種方法曾用于因用其它方法傳代導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡操作的間充質(zhì)干細(xì)胞、DC細(xì)胞的培養(yǎng)，效果非常滿意。具體過(guò)程是：1）、用較多的4度的PBS洗滌一遍細(xì)胞(以6孔板為例，加1.5ml/孔)，2）、再加0.5ml 4度的PBS，靜置操作臺(tái)上，很快細(xì)胞就小片脫落，3）、輕輕吹打，細(xì)胞即完全脫落，4）、按一定比例傳代。
消化時(shí)間和干細(xì)胞類型、消化液的消化能力、干細(xì)胞的密度等多種因素有關(guān)。干細(xì)胞消化過(guò)程要注意消化時(shí)間。一般養(yǎng)一種新的干細(xì)胞要摸索一下消化時(shí)間，掌握干細(xì)胞消化到什么程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強(qiáng)，配好后可分裝成小管，一次用完，其余凍在－20℃，以保持酶活力。消化液只需鋪滿瓶底即可，可放入培養(yǎng)箱中，因外在37℃時(shí)酶的活力高于常溫，有利于縮短消化時(shí)間。還有一種方法，就是將胰酶鋪滿瓶底后，輕搖培養(yǎng)瓶，使胰酶與干細(xì)胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待干細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可。細(xì)胞生長(zhǎng)到覆蓋70～80％瓶底時(shí)消化較好，若干細(xì)胞密度過(guò)大則消化后干細(xì)胞易成團(tuán)。
消化時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘，否則對(duì)干細(xì)胞損害很大。消化液覆蓋干細(xì)胞，成一薄膜，然后反復(fù)傾斜，使消化液沖刷干細(xì)胞，當(dāng)干細(xì)胞收縮，部分干細(xì)胞脫落時(shí)，可用完全培養(yǎng)基馬上中和，同時(shí)吹打壁上干細(xì)胞。 / C3 x( J4 ?$ k+ D; \
在消化過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)胞鋪不開的問(wèn)題，原因有二：一是消化時(shí)離心管中的細(xì)胞沒有吹打開，解決方法是離心后的細(xì)胞加3ml左右的培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，吹打開后，再加培養(yǎng)基，這樣細(xì)胞不會(huì)成團(tuán)，培養(yǎng)基太多，細(xì)胞不容易吹打開。二是接種時(shí)，培養(yǎng)瓶中先加培養(yǎng)基，再接種細(xì)胞，接種后輕輕晃動(dòng)搖勻。先加細(xì)胞后加培養(yǎng)基或不晃動(dòng)搖勻，其結(jié)果就是細(xì)胞鋪不開。 二、 貼壁干細(xì)胞的傳代擴(kuò)增
貼壁干細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成份也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。 對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞，可以直接吹散后分瓶。而對(duì)于貼壁較緊的干細(xì)胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般過(guò)程為： " p2 }' B& i% e, X$ P# | 將長(zhǎng)成致密單層干細(xì)胞的細(xì)胞瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去； 加入0.25％胰酶溶液，視細(xì)胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使充分浸潤(rùn)； 一般消化時(shí)間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去胰酶溶液，并加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化； E7 E$ s4 a5 _! T3 `% s* F! I 視實(shí)驗(yàn)要求分入多瓶繼續(xù)培養(yǎng)，一般為一傳二到一傳四的比例。 傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)： r; o; c: `2 q% F! W8 B
1.嚴(yán)格的無(wú)菌操作 . 2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)干細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。 |
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來(lái)自： 一土山人 > 《Biotechnology》
