一、免疫熒光法
１．直接法
（1）冰凍切片、涂片、印片或單層細胞培養物按要求進行固定，石蠟切片常規脫蠟后用酶消化處理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分鐘，冷風吹干，放入濕盒中。
（2）滴加經稀釋的熒光抗體，37℃ 30-60分鐘或4℃ 過夜
（3）PBS 洗2次，蒸餾水洗1次
（4）50%甘油緩沖液封片
（5）熒光顯微鏡下檢查
（6）對照染色
①陽性對照，用已經證實的含有靶抗原的組織切片與待檢標本同樣處理，結果應為陽性。②陰性對照，用確知不存在靶抗原的組織切片與待檢標本同樣處理，結果應為陰性。③空白對照，用免去特異性抗體或用PBS替代特異性抗體，結果應為陰性。④抑制試驗，將標記抗體(例熒光抗體)和未標記的抗體或血清等量混合后，按上述步驟處理切片，結果應為陰性（一步法）。或將待檢切片兩張，一張加未標記特異性血清，另一張加未標記同種正常血清，孵育后沖洗，再加入標記的特異性血清（例如特異性熒光標記抗體），加了未標記特異性血清的切片因抗原抗休已結合，故染色被抑制，呈陰性結果，而加同種正常血清的切片則呈陽性反應（二步法）。
對照染色非常重要，開始試驗時應做全面對照，每次試驗時應做陽性和陰性對照。
2．間接法
（1）標本處理同直接法。
（2）滴加適當稀釋的特異性抗體于標本上，置濕盒中，３７℃ ３０～６０分鐘或４℃過夜。
（3）滴加適當稀釋的間接熒光抗體，置濕盒中，３７℃ ３０～６０分鐘。
（５）ＰＢＳ洗２次，雙蒸水洗１次。
（６）甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下觀察。
（７）對照染色：可用空白對照和陰性對照等。
３．補體法
（１）標本處理同直接法。
（２）滴加適當稀釋的特異性抗體及補體的等量混合液，置濕盒中，３７℃３０分鐘，ＰＢＳ洗３次。
（３）滴加適當稀釋的抗補體熒光抗體，置理盒中，３７℃ ３０分鐘。ＰＢＳ洗２次，蒸餾水洗１次。
（４）甘油緩沖液封片。
（５）對照染色，可作正常血清替代，滅活補體對照即經５６℃ ３０分鐘滅活處理后，將滅活的補體與特異性抗體等量混合，進行染色，結果均應陰性。
４．雙重色疫熒光法
在同一標本上有兩種抗原需要直接顯示時，可用不同的熒光素分別標記抗體進 行染色。
一步法雙染色：先將兩種標記抗體按適當比例混合，按直接法步驟進行。
二步法雙染色：先用一個標記抗體孵育，不必洗，再用另一個標記抗體孵育，按間接法步驟進行。
５．注意事項
（１）免疫熒光法最適宜進行冰凍切片的染色，因為此種切片一般抗原保存得較好。若是石蠟切片則應首先選用免疫酶法等染色技術。
（2）使用商品的熒光標記抗體，在進行染色前應作抗體效價的測定，找出合適的稀釋度后再進行成批染色。一般而言，在陽性物質發出明亮熒光而背景又較暗時的稀釋度是較為合適的。高稀釋度的熒光抗體可以減少非特異性著色使染色結果更具特異性，但稀釋度過高會導致假陰性的出現。低稀釋度的熒光抗體使結果較易觀察，但會帶來非特異性的著色，甚至出現假陽性的結果。
（3）非特異熒光的消除。非特異性熒光的消除方法較多。一般而言，冰凍切片的非特異性熒光較強，石蠟切片的非特異性熒光較弱。常用的方法有①先用非免疫血清如10％牛血清等處理切片，然后再行熒光染色。②用小鼠相應組織的干粉吸收熒光抗體中的非特異性成分。③選擇合適的稀釋度和切片。④選用高特異性和高效價的熒光抗體。
（4）洗滌要徹底。每道程序都有用蒸餾水或緩沖液洗滌以清除殘留在切片中的試劑，以達到特異著色的目的。洗滌時不論是沖洗還是振蕩洗滌，其基本原則是要達到洗滌干凈的目的，或者說充分稀釋上一道程序中的試劑，使其含量降至最低。一般只要有足夠的時間，以靜置廷長每次洗滌時間為宜，這是防止脫片的較好辦法。洗滌液的PH值應為7.2~7.4之間，過高過低的不利于染色過程，尤其是在偏堿的PH值條件下。
（5）孵育時間與溫度。免疫熒光法一般孵育溫度在37℃，時間為20——30分鐘時是最佳時間與溫度。當然，也與抗體的效價，組織抗原的含量與部位，切片的厚度等有關。
