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結直腸癌KRAS基因突變檢測專家共識導語：全球結直腸癌每年新發病例數約120萬，年病死人數超過60萬，發病率居第3位，病死率居第4位。近些年，結直腸癌的發病率呈明顯上升趨勢。因此，結直腸癌的治療一直是國內外學者研究的熱點。隨著靶向治療藥物表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑西妥昔單抗（Cetuximab）和帕尼單抗（Panitumumab）的問世，結直腸癌的治療進入了靶向治療時代。
全球結直腸癌每年新發病例數約120萬，年病死人數超過60萬，發病率居第3位，病死率居第4位。近些年，結直腸癌的發病率呈明顯上升趨勢。因此，結直腸癌的治療一直是國內外學者研究的熱點。隨著靶向治療藥物表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑西妥昔單抗（Cetuximab）和帕尼單抗（Panitumumab）的問世，結直腸癌的治療進入了靶向治療時代。 多個大樣本、多中心Ⅲ期臨床研究結果提示，KRAS基因第2號外顯子第12、13位密碼子的突變狀態與阻斷EGFR的單克隆抗體——西妥昔單抗、帕尼單抗的療效明確相關，KRAS野生型的患者可以從西妥昔單抗和帕尼單抗的治療中獲得最大化的生存效益，從此結直腸癌的治療揭開了個體化治療的新篇章。早在2009年，美國臨床腫瘤學會（ASCO）即建議對于轉移性結直腸癌患者，在選擇抗EGFR的單抗藥物（西妥昔單抗或帕尼單抗）治療前應檢測KRAS基因狀態。美國《國家綜合癌癥網絡（NCCN）結直腸癌臨床實踐指南》（2011年）也指出，使用西妥昔單抗或帕尼單抗的患者應檢測腫瘤KRAS基因突變狀態。中國衛生部頒布的《結直腸癌診療規范（2010年版）》中推薦西妥昔單抗用于治療KRAS基因狀態野生型患者。 同前有關KRAS基因突變的檢測方法很多，參與檢測的機構眾多，缺乏統一的標準，本文旨在就現有的KRAS的檢測流程以及常用檢測方法給予簡要介紹和評價，為臨床病理工作提供指導。 一、檢測標本 1.標本類型：（1）手術切除的標本：新鮮組織和（或）石蠟包埋組織；（2）腸鏡等活檢標本；手術切除標本及活檢標本均且有的病例，建議用手術切除標本進行檢測；（3）血液：應用血液標本進行檢測目前尚處于研究階段，不推薦應用。 2.標本處理：（1）新鮮組織直接提取DNA。（2）石蠟包埋組織的標本處理：所有標本離體后及時進行標記、切開、固定等處理。應用新鮮配制的4%中性甲醛緩沖液固定標本，避免使用Bouin液等含重金屬離子的固定液。固定液的量應至少為組織體積的10倍。活檢標本固定6-12 h，手術標本固定6～48 h。固定溫度以正常室溫為宜。蠟塊保存溫度在32℃以下。 二、檢測方法 1.組織獲取：所有標本進行基因突變檢測前均先行常規病理檢查和診斷（HE染色），必須經有經驗的病理醫師確定健康腫瘤細胞的百分比（腫瘤細胞/整張切片所有細胞，估算），必要時應采取富集腫瘤細胞的方法，如手工刮取（macrodissection）或顯微切割法（microdissection）。選取以腫瘤細胞為主的、沒有明顯的壞死、黏液和炎性改變的組織進行檢測。腫瘤細胞數量要求尚無統一標準，至少應有100個腫瘤細胞，具體視所用DNA提取方法和突變檢測方法的敏感度等而定。 2.DNA提取：DNA的質量很重要，一定要按標準的操作程序提取DNA，并進行嚴格的質控。目前沒有統一的標準方法，對于手術標本，可采用常規的商品化DNA提取試劑盒。對于活檢標本，推薦使用能提取石蠟包埋組織微量DNA的試劑盒。提取的DNA建議先測定濃度，并進行質量評估后再用于基網突變檢測。 3.突變檢測方法：方法很多，目前沒有統一標準，各實驗室可以根據實際情況選擇應用，同時應充分了解所用檢測方法的優缺點及局限性。所有方法建立前應進行有效性驗證。表1中列出了KRAS基因常見的突變類型。 表1 KRAS基因常見突變類型
（1）直接測序（direct sequencing）法：是目前應用最多的一種檢測方法，主曼是Sanger測序法。其基本原理是進行DNA合成反應時，正常摻入dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）會使DNA鏈延伸，如果摻入dideoxyNTP（ddNTP），則會使DNA鏈延伸終止。DNA片段是熒光標記的，這些片段經過平板膠電泳或毛細管電泳得到分離，熒光分子被激發而發光，發出的光信號可被檢測系統檢測。突變基因需要超過20%才能檢測到突變信號。優點是能檢測到已知突變和未知突變位點。但操作步驟多，檢測周期較長。 （2）熒光即時定量PCR法（real-time PCR）：通過檢測熒光，實時監測PCR反應進行的過程。基于real-time PCR的方法較多，下面就兩種常見的技術方法做簡要介紹。①ARMS（amplification refractory mutation system）法：該方法是利用與熒光探針相連的特定引物（蝎形或環形）進行的即時定量PCR。通過將與探針部的突變部位結合的鄰近堿基（第2個堿基）與錯配的堿基替換，并與阻斷延伸反應的“ARMS”技術結合，提高特異性，從而可以進行高靈敏度測定。靈敏度1%左右，只能檢測已知突變位點。②Taqman探針法：在real-time PCR反應中加入特異的KRAS野牛型和突變型探針，通過特異性擴增曲線判讀基岡是否突變。靈敏度1%左右，只能檢測已知突變位點。 三、質量控制和保證 美國病理學家協會（CAP）目前提出的檢測方法主要為直接測序法、ARMS法及Taqman探針法等。2010年8月在京召開了約20家病理實驗室負責人參加的討論會，與會專家討論認為國內應用于KRAS突變檢測的方法主要也是CAP提出的3種方法。 按照ASCO暫定的臨床意見，KRAS基因突變檢測應在CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendment Accredited Laboratory）認可的實驗室進行，但國內尚無此類實驗室，故初步要求如下： 1.必須在有質量控制及質量保證（QC/QA）的實驗室進行檢測，實驗室應建立完善的標準化操作程序（SOP）。 2.所有檢測必須嚴格按該方法的SOP要求進行。 3.每種檢測方法建立前需進行有效性驗證，選擇2～3個或更多有質量保證的中心實驗室進行對比驗證，一致性應＞ 90%。 4.每年應定期進行1-2次內部及外部質評。 5.進行檢測的技術人員及醫師必須經過必要的培訓及考核。 6.檢測相關的儀器設備必須定期維護和校驗。 7.留存可溯源樣本供質控參比驗證。 四、申請單 申請單應包含以下基本內容： 1.患者基本信息及病理診斷； 2.標本性狀及類型； 3.臨床資料、家族史和治療史； 4.知情同意簽字和電話； 5.要檢測基因項目和方法。 五、檢測報告 檢測報告時間需5-10個工作日，如需重復檢測，時間相應延長。 突變檢測報告應包含以下內容： 1.患者基本信息及病理診斷； 2.標本性狀及類型； 3.標本質量及大小； 4.獲取的腫瘤細胞數量及所占細胞總數的百分比； 5.DNA提取方法及突變檢測方法； 6.檢測結果：KRAS基因野生型，未檢測到KRAS基因目標位點突變；KRAS基因突變型，詳細報告突變化點和密碼子類型； 7.診斷性報告：應保存或附上可溯源的原始檢測圖譜，診斷醫師在報告單上簽字。 |
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