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中西醫結合專業研究生班講座 題目：中藥藥理研究方法簡介
中藥現代化研究是離不開藥理學的研究方法，而藥理學的研究方法又主要借助于生理學、生化學、免疫學、分子生物學和形態學的方法和手段逐漸發展起來。在中藥藥理研究過程中，方法的選擇是至關重要的，而中醫中藥的研究又有其獨特的方面，即中醫的病癥與現代醫學研究采用的模型是否吻合，用現代醫學研究的方法和手段能否反映出中醫中藥研究的特色，這是多年來中西醫研究過程中一直在探討和需要解決的問題。下面僅從幾個方面粗淺地介紹藥理學研究過程中的一些常用的方法和手段，旨在為中醫中藥的研究提供參考。 一、 概 述 （一）基本研究方法 1. 離體實驗（體外實驗） （1）離體器官：心臟、子宮、腸管、氣管、血管條、神經等； （2）離體組織：腦組織（海馬腦片培養）、肝組織培養； （3） 體外培養細胞：血細胞、心肌細胞、腦細胞、膠原細胞、腫瘤細胞、試管內或培養基內的細菌和病毒等； （4）體外實驗的優點：實驗重復性好，用藥量少（適合于提取合成的藥物），節省動物，效果直觀，主要用于藥物作用機制的分析； （5）體外實驗的不足：實驗條件要求嚴格，結果易受藥物中的雜質和理化性質的影響，有時與整體實驗的結果不符合。 2. 整體實驗：包括正常動物和病理模型。 （1）正常動物實驗：觀察在正常機體機能狀態下，藥物產生的影響。如藥物對正常動物血壓的影響，對動物行為活動的影響。又分為急性實驗（短期內如一次給藥或連續3~7天給藥）和慢性實驗，如藥物長期毒性測定，藥物延長壽命實驗等。 藥物對正常動物產生的作用只能說明藥物作用的趨勢，并不能完全說明藥物就對該系統的疾病狀態產生治療作用。 （2）動物的病理模型 l 模型的制造： 腎虛模型 高血脂模型 高血壓模型 心肌缺血模型 癡呆模型 抑郁模型 l 模型的特異性：制造的模型是否與臨床疾病的病理、病理生理過程吻合，有效的 治療藥物能否改善模型的某些癥狀，藥物在模型上的治療作用能否在病人身上同樣有治療作用。如用于抑郁和抗抑郁藥研究的抑郁動物模型。 l 模型的選擇：根據研究的目的和要解決的問題有針對性的選擇模型。如補腎壯陽 藥要選擇腎虛模型，要觀察藥物對動物耐力的影響；益智藥研究要選擇呆傻的動物模型（認知、記憶和鞏固的不同階段觀察藥物的作用）等。 （二）研究題目的選擇： 中醫學理論淵博久遠，中藥資源是我國的寶庫，具有廣大的研究潛力，作為研究生如何在有限的時間內選準題目，進行有意義的研究。下面僅就中藥研究方面提出幾點想法。 1. 尋找秘方、驗方，進一步發掘； 2. 在驗方的基礎上，重新組方； 3. 開拓秘方、驗方新的適應癥； 4. 單味藥有效部位、有效成分的研究； 5. 中藥復方和單方制劑的研究。 （三）實驗設計 1. 建立實驗假象 2. 根據實驗目的，確定實驗動物、觀測指標、動物模型 動物的選擇：注意動物對藥物反應的特異性 （1）觀測指標：客觀性和可測量性（定量或定性） （2）動物模型：除觀測藥物對正常動物的影響外，還要在疾病的動物模型上進行研究，如降壓藥（正常動物，腎性高血壓模型，自發性高血壓模型） 3. 劑型、劑量、給藥途徑和給藥時間 （1）劑型：選擇劑型的原則是在保證藥物活性不變的情況下，選擇便于保存、攜帶、用藥和充分發揮藥效的劑型，同時注意中藥的特點。 （2）劑量：實驗研究所用劑量的確定主要根據藥物的LD50。如果實驗藥物分為3個劑量組，則高劑量組是1/10 LD50, 中劑量組是1/30LD50，低劑量組是1/90LD50；如果研究用藥的LD50測不出來的話，根據臨床用藥量按體表面積進行換算。 （3）給藥時間：根據臨床用藥的經驗和研究的目的決定 實驗用藥每天給藥的次數和天數。 （4）給藥途徑：與臨床給藥途徑相一致。 4. 實驗分組： 空白對照組 模型對照組 陽性藥物對照組 實驗用藥組 每組動物所用的例數根據實驗設計的要求而定。 5. 實驗設計的基本原則： （1）重復 （2）隨機 （3）對照：組間對照 自身對照 配對對照 （四）實驗結果的處理和分析 1. 結果正確性的判斷：實驗條件控制的嚴密性，實驗數據的客觀性，技術上有無問題，實驗設計上有無漏洞（慎密的實驗設計是非常重要的）等。 2. 結果的統計學處理：根據實驗資料選擇不同的處理方法。注意的問題是： （1）不要隨意拋棄數據，如偏差過大的數據（超過3個SD）可廢棄不用。 （2）注意有效數字和誤差之間的關系：測量所得數字的位數，用來表示測量的精密度如： a. 2.5~3.5 3.0 2.95~3.0 3.00 2.99~3.00 0.001 是1位有效數 0.0025 是2位有效數 b. 應用百分數時要注意： （a）分母不能太小，如1/3不等于33.3%；1/5不等于20%。 （b） 測得20只動物死亡率是50%，10只動物死亡率是10%，100只死亡率是5%，不等于50%+10%+5%/3 =21.7%，而是50%x20+10%x10+5%x100/20+10+100 =12.6%。 （c）A組死亡率是90%， B組死亡率是30%；錯誤的比較是 A/B=3倍，B/A=1/3倍；正確是A-B=60%。 3. 數據的表達： （1）表格 （2）線條圖 （3）照片 （五）影響實驗的因素 1. 動物因素： （1）種屬差異：包括量和質的差異，如巴比妥類藥物對不同種屬動物催眠時間的差異；組胺可使貓、狗血壓下降，而使兔血壓升高，豚鼠支氣管收縮，回腸平滑肌興奮增高。酒石酸銻鉀可使狗、貓、鴿子嘔吐，但兔和大鼠不吐。兔對阿托品類降壓不敏感（體內代謝快）。 （2）性別差異：不同性別大鼠對有機磷毒性反應不同，對環己巴比妥的催眠時間有差異。所以，實驗時要雌雄均用。 2. 環境因素：不同溫度氯丙嗪的 LD50不同（低溫或高溫時，LD50小，毒性大）；苯 丙胺在高溫時死亡率高；一只籠子放1只鼠死亡慢，放5只鼠死亡快。不同季節蛙對洋地黃的最小致死量不同；食物中含二甲基硫胺、苯吡喃酮不同，小鼠腫瘤發生率不同。 3. 藥物因素：藥物的溶解度、吸收情況、給藥途徑、試劑是否標準等。實驗中的誤差 主要來自系統誤差如天平稱量不準，不同天平精密度不同，量筒和滴定管的差異等。稱量藥物量越少，誤差越大；溶液稀釋時，一次稀釋誤差小，稀釋多次誤差大。
二、藥理實驗常用的方法介紹 （一）心血管藥物的實驗方法 1. 強心作用藥物的實驗方法 （1）了解心衰時病理生理變化： ◇ 心肌收縮力減弱 ◇ 心臟負荷增加 ◇ 神經體液調節失常 ◇ 心肌肥厚 （2）在體心臟方法： △ 心肌收縮力的測定：動物選用犬、貓或兔，麻醉、固定、開胸手術，暴露心臟，于右肺動脈根部及左心尖處各逢一線，連于心臟描記器，記錄心肌收縮曲線。6%戊巴比妥鈉（約20-60mg/kg）靜脈注入，造成心衰。然后，給予所試藥物，測定有無強心作用。 △ 心臟血流動力學測定：動物方法同上。心臟暴露后，于心尖部插入一導管，測 定心室內壓；分離主動脈根部和左冠狀動脈，測定主動脈流量和冠脈流量；及分離股動靜脈，測定血壓、給藥和動靜脈氧含量。 觀測指標：LVDP, LVEDP, ±dp/dp（max）, 心臟指數，心博指數，血壓，平均動脈壓，心肌耗氧指數等。 △ 心肌組織學檢查：取衰竭心臟和治療后心臟做組織學檢查，觀察藥物對心肌結 構的影響。 （3）離體心臟實驗： △ 離體蛙心實驗 △ 離體心肌實驗：取貓、豚鼠、兔、狗的乳頭肌放入充滿K-H液的浴槽中，通氧，描記收縮曲線，比較給藥前、后的收縮幅度。 △ 體外培養心肌細胞實驗：取乳鼠心室肌，剪碎，胰蛋白酶消化成單細胞，培養48小時，鏡下觀察和比較給藥前后不同時間細胞搏動的情況。 △ 心肌細胞酶實驗：測定ATP酶的活性。 2. 抗高血壓藥物實驗方法 降壓藥與抗高血壓藥的區別：有降壓作用的藥物并不一定能用于治療高血壓，如氨茶堿；酚妥拉明能夠擴張血管，但不一定降壓。 （1）根據高血壓發生的機制，藥物選擇的作用靶點： △ 減少血容量 △ 降低交感神經的張力 △ 擴張血管 △ 抑制血管緊張素轉換酶 （2）藥物對正常動物（清醒或麻醉）和離體血管條的作用：從實驗結果中推測藥物是否具有降低血壓的趨勢。 （3）藥物對實驗性高血壓模型的降壓作用： △ 神經原性高血壓模型（Neurogenic hypertension） a. 刺激高級神經中樞：緊張性勞累性精神刺激（電、化學、物理刺激）； b. 切除頸動脈竇、主動脈弓減壓神經； c. 損傷延腦孤束核：手術機械損傷或給予強烈的電刺激或化學損傷（6-羥多巴胺） d. 注射膠體于硬腦膜腔內，使腦壓升高； e. 向腦室內注入藥物，如血管緊張素 △ 腎性高血壓模型（Renal hypertension） 利用結扎法、夾住法或一側切除法形成慢性單腎或慢性雙腎腎性高血壓，然后評價藥物的作用。該模型主要反映高腎素型高血壓。 △ 鹽皮質激素性高血壓模型（Hormonal hypertension, DOCA） 鹽皮質激素具有保鈉、保水，增加血容量，升高血壓；同時，又使得中樞α2受體活性降低，而發生高血壓。在評價藥物時可與慢性腎性高血壓模型配合。 △ 高鹽性高血壓（Hypertension with high salt intake） 形成機制：血容量增加；血管反應性改變，對內源性血管活性物質反應性增高，而發生高血壓。 △ 自發性高血壓大鼠模型（ Spontaneous hypertension rat, SHR ） 將高血壓大鼠近親交配可獲得SHR。SHR大鼠成功率雄性90%，雌性58%。 SHR亞型： 肥胖型高血壓：SHR+高血脂 動脈粥樣硬化型高血壓：SHR+高膽固醇 卒中型高血壓：SHR+腦癥狀 （4）抗高血壓藥降壓機制分析 △ 離體實驗 △ 血管平滑肌細胞培養，測定對各種離子的影響 △ 對交感神經放電的影響 △ 對內源性血管活性物質的影響 3. 抗心律失常藥動物實驗 （1）動物選擇： △ 種類：除離體蛙心外，不選擇冷血動物；大動物與小動物的區別，小動物（鼠、兔、豚鼠、貓）形成室顫時心臟可以自行恢復（環行傳導通路短，當沖動落在不應期時可以消失），而大動物（狗、猴、豬）則不易自行恢復。小鼠和大鼠對誘導心律失常藥物哇巴因不敏感，而豚鼠對其敏感（幾千倍），貓、狗、豬敏感，與人相似。 △ 標本：離體心臟，離體心房、心室乳頭肌、心肌細胞等。 △ 給藥方法及評價：大鼠心跳300-400次/分，小鼠心跳400-600次/分，兔心跳200-300次/分，貓、狗心跳100多次/分，以心電圖二導聯記錄心電變化評價藥物的作用。 治療給藥（自身對照）：在心律失常時給藥； 預防給藥（組間對照，口服給藥多在1小時前，靜注時1-5分鐘可立即給藥）：比較心律失常持續時間、程度。 （2）實驗方法： ◇ 電刺激法： a. 整體實驗：麻醉動物（貓、兔），給予適當的電刺激，引起可逆性心律失常（對 心臟幾無損傷）。 方法：電極放置在主動脈處，形成心房心律失常；電極放在心室上，引起室性心律失常。根據刺激強度控制心律失常的程度，一般以房顫、室顫為指標，找出給藥前閾值，給藥后再找出閾值，進行閾值比較。閾值多為2-3次的均和，每隔3分鐘刺激一次，給藥后10~15分再重復刺激。 b. 離體標本：將電極放置心臟表面，找出給藥前后最大耐受，比較給藥前后的變化。 （也可測定REP） ◇ 冠狀動脈結扎法： a. 動物：狗、貓、兔、大鼠 b. 部位：冠脈左前降枝，結扎部位不同，死亡率不同 c. 結扎方法：二期結扎法，首先不扎實，促進側枝循環代償，30分鐘后再扎實， 可降低死亡率。結扎后5-7小時可出現室性早博到室速；10-36小時可以進行實驗。 d. 原理：結扎后→心肌缺血→興奮性增高→異位節律 →心肌損傷→釋放出K+→對心肌產生抑制 ↓ 上述作用使得心肌不協調，加重心律失常 e. 缺點：對利多卡因效果差。 ◇ 化學物質引起的心律失常： a. 氯仿（CHCl3）：主要作為藥物的篩選。動物為小鼠，吸入氯仿3-5分鐘，呼吸 停止，取出心臟，可見心室纖顫。利多卡因、苯妥因鈉效果差，而其它藥物多有效。發生的機制認為與植物神經系統、腎上腺髓質有關。 b. 腎上腺素：兔，靜脈快注腎上腺素（10-100μg/kg），但形成心律失常持續時 間短，約2-5分鐘，多出現室早、室速和室顫。此法的優點是可反復給藥，每隔1小時重復，自身對照，并可觀察抗心律失常藥作用持續的時間，心得安效果最好。 c. 烏頭堿（Aconitine）：與熱不穩定，容易被破壞。局部用藥（濃縮后滴在心 臟上或以結晶放在心臟上）引起房性心律失常；全身靜脈給藥（20-30μg/kg,股靜脈或舌靜脈給藥）引起室性心律失常（Vp→Vt→Vf）。大鼠、豚鼠、兔出現心律失?？删S持40-60分鐘，室速可維持60分鐘以上或2-3小時以上。主要影響0相動作電位促進Na+內流，又叫Na+通道開放劑。 d. 氯化鋇（Bacl2）：動物選擇大鼠或兔。大鼠多以烏拉坦麻醉，給予氯化鋇 5mg/kg；兔多以水合氯醛麻醉（300mg/kg,ip），給予氯化鋇4mg/kg，水合氯醛可協助氯化鋇產生心律失常。氯化鋇多引起室性心律失常，可持續15分鐘。發生機制：Ba與Ca相似，過量引起興奮；Ba加快0相除極速率，并開放Na通道；與交感神經興奮有關?？剐穆墒СＫ幘蓪?span lang="EN-US">Ba引起的心律失常。 e. 氯化鈣：普氏纖維對Ca敏感，而當心肌興奮時，普氏纖維則又抑制，使得心 臟跳動不協調、分離，而發生心律失常；同時，Ca又興奮交感神經?？梢鹗倚孕穆墒С＃珓┝侩y以控制，Vt與Vf劑量范圍小。觀察指標：是否出現心律失常，Vf或死亡，然后進行比較。 f. 哇巴因：引起心律失常出現快，多用犬、貓、豚鼠，靜脈給藥。給藥原則是 先iv臨界量，然后每隔3分鐘注入一定量，直到心律失常。記錄：Vp出現的時間、容量；Vt時間、容量；Vf時間、容量；死亡時間、容量。對照組與給藥組分別以時間、容量進行比較。 4. 抗心肌缺血實驗 心肌梗塞病理模型是研究心肌缺血的一種方法,作為篩選抗心肌缺血藥物有如下規程。 (1) 藥物篩選過程： l 小鼠常壓或低壓耐缺氧實驗 a. 測氧儀測定動物死亡時氧余存量或不同時間耗氧速率 b. 對抗異丙腎上腺素增加心肌耗氧量的作用比較 c. 生化指標：心、腦乳酸和糖原含量 l 對抗垂體后葉素引起的心電圖缺血改變 l 制造犬心肌缺血病理模型 (2) 動物： l 犬：優點：解剖特點類似于人的解剖 犬的心臟占犬體重比例大 犬的冠脈清楚，易于操作 抗心律紊亂能力強 缺點：犬心側枝循環豐富，如果條件不恒定會影響實驗結果。 l 貓、大鼠：價格便宜，但心律紊亂后易引起死亡。 l 兔：冠脈變異大，結果不一致。 （3）心臟冠脈解剖學特點： 冠脈分為： 右冠脈 左冠脈：左旋枝 左前降枝(LAD)：供給左、右心室的一部分和室間隔2/3的血供，結扎LAD可致左心室前壁心肌梗死。 （4）方法： ◇ 結扎法： l 結扎部位： a. LAD上1/3處 b. LAD的中點 c. LAD的下1/3 d. LAD和左旋枝的分支均結扎 e. LAD的1/2和大的側枝結扎（優點：梗死范圍清楚、恒定；要 求：LAD全長>6cm,大斜支>4cm） l 二步結扎法：以5-51/2的針頭插入動脈內結扎，30分鐘后拔出針頭，全扎?？煞?/span> 止心肌突然缺血，發生心律紊亂。 l 一步結扎法：結扎前iv利多卡因8mg/kg，預防心律紊亂。 l 心導管插入法：在心尖部做一荷包式縫合，用針將心肌穿透，插入心導管于心室 內，導管內放入NS+肝素（1mg/ml）；另一端接換能器，測定心室內壓。 l 觀察指標： 缺血程度：∑ST和NST（范圍） 缺血范圍：N-BT染色（氯化硝基四氮唑蘭） 心外膜心電圖：S-T段抬高反映心外膜缺血 S-T段下移反映心內膜缺血 S-T段在6-7小時后恢復正常，故藥物應在1/2-1小時內給予，避免假陽性。 血液動力學：a. BP(mBP) b. HR c.心肌耗氧指數= mBP x HR d.左心室內壓：LVPSP（收縮峰壓）反映心肌收縮力 LVEDP（舒張末期壓）反映心肌灌流狀況 生化指標：測定乳酸、GOT（谷草）、CPK（磷酸激酶）等酶的活性和O2、CO2。酶的活性增高與心肌梗塞的范圍是呈正比。 心梗范圍（MIS）：作為藥物是否有抗心肌缺血的主要指標。 a. 國外在犬的心外膜上放置許多電極，以ST升高的個數作為梗塞范圍； b. CPK曲線（數學推導） c. 組織化學染色法（N-BT染色）：非缺血區呈深藍黑色，缺血區呈灰白色，剪下缺血片稱重/左心室重量x100%，表示梗塞范圍。 l 整個實驗過程： a. 選狗：強壯、毛光亮，10kg以上，X光、心電圖檢查。 b. 麻醉：戊巴比妥鈉25-30mg/kg c. 氣管插管 d. 左側第5肋間開胸 e. 結扎后觀察24小時，然后取出心臟。 ◇ 阻塞法：氣囊阻塞，水銀阻塞，微球法 ◇ 藥物模擬心肌缺血： l 垂體后葉素：動物選用清醒狀態大鼠。 垂體后葉素→冠脈、全身血管收縮→阻力增加→血壓升高→心臟后負荷增加→心肌缺血 觀察指標：ECG指標：J點，ST和T波變化 注意：動物對垂體的耐受性，恒速給藥，同批藥。 l 異丙腎上腺素、腎上腺素：增加心肌耗氧量，心肌缺血。
附表： 表1. 動物心率、P-R間期及Q-T間期
表2. EKG的P波形態、時間及電壓
表3. QRS波群
S-T段： 猴：Ⅰ導等電線； Ⅱ導、Ⅲ導和aVF是等電線或降低，而aVL、aVR呈等電線或升高， 總平均偏移度為0.03mv左右；胸導聯S—T 段均為下降，總偏移度0.08mv ,呈斜 升型。 狗：90%為等電線，10%下降或上升，呈斜升型<0.1mv. 兔：偏移較少，4%Ⅲ導、aVF降低0.05mv；2%Ⅰ導、aVL抬高0.05mv，一般不超過0.1mv。 鼠類：大、小鼠無明顯S-T 段。 表4. T波
5. 降血脂動物實驗： （1）正常動物的初篩實驗： 動物：大鼠、小鼠、雞、兔等； 正常大鼠血清總膽固醇濃度約為：92.67±1.87mg%，若試驗藥物能降低大鼠血清總膽固醇20%，可認為有降膽固醇作用，值得進一步研究。 （2）高血脂癥動物模型： 動物：大鼠 方法：高膽固醇飼料（1~4%膽固醇，10%豬油，0.2%甲基硫氧嘧啶，86~89%基礎飼料）喂養，每天15~20g，持續2~4周，用于降血脂實驗。 （3）高血脂及動脈粥樣硬化模型 動物：兔 方法：兔對高膽固醇飼養非常敏感，短期內能誘發明顯的病變。在飼料中加入高脂肪和高膽固醇后，主動脈斑塊發生率達100%，大約6周可以形成，用于觀察藥物的作用。 測定指標：主動脈大體形態學觀察 光鏡下觀察：內皮細胞增生腫脹，內皮下層增大和脂質沉著，并出現泡沫細胞。 電鏡觀察：內皮細胞的完整性；分析內皮細胞間隙的改變。 （4）動脈粥樣硬化的生化測定 血清膽固醇、血脂蛋白、游離脂肪酸； 肝脂酶（HL）、脂蛋白脂酶（LPL）、卵磷脂膽固醇?；D移酶（LCAT）、HMG-CoA還原酶活性的測定； 脂質過氧化物（LPO）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性測定； 脂蛋白受體功能的測定：LDL受體的RIA測定。 （5）細胞培養實驗 血管內皮細胞培養：觀察內皮細胞形態，3H-TdR 摻入測定，LDH測定。 （6）有關因子及基因表達實驗 血小板源性生長因子（PDGF）及c-myc mRNA與蛋白表達 PDGF-B mRNA表達
（二）中樞神經藥物實驗方法 中樞神經有著龐大、復雜的結構特點和功能，如血腦屏障、各種結構不同功能各異的神經細胞、神經核團、腦區和多種神經遞質的調節。因此，神經系統疾病和治療藥物的研究存在一定的困難，在藥物研究過程中應該充分考慮到這些情況。下面僅就神經系統幾種常見疾病的藥物研究介紹一些方法。 1. 抗癲癇藥物實驗 （1）最大電休克發作實驗（MES） MES是癲癇大發作動物模型，受試藥若能對抗MES，則該藥在臨床上可能對癲癇大發作有效。 l 動物：小鼠或大鼠 l 儀器：電驚厥儀，刺激電極（耳電極或角膜電極），刺激參數：小鼠電流50 mA，電壓100v；大鼠電流150mA，電壓180v；刺激時間0.2-0.3s。 l 觀察指標：驚厥發展有四期，潛伏期、強直期、陣攣期、驚厥后期。以后肢強直性驚厥出現與否為準，若給藥后此期不出現說明此藥有抗MES作用。 （2）聲源性發作法 某些敏感動物受到強的鈴聲刺激時，能產生一種定型的運動性發作，稱為“聲源性 發作，AS”。屬于癲癇大發作模型。 l 動物：大鼠或小鼠, 一般需培育純種AS陽性鼠，通過近親交配，至少超過20代， 可得到純種AS陽性鼠，達到50％以上（北京醫科大學藥理室培育的P77-PMC鼠）。 l 方法：選擇聲源性敏感的大鼠（鈴聲刺激60秒或90秒能產生奔跑或驚厥者），放 入聲源性發作箱，箱內裝有電鈴，產生的音量約為110－120分貝。當給予鈴聲刺激時，動物便開始奔跑，倒地、抽搐、驚厥。AS反應強度分為5級： 1級 0分，陰性反應 2級 10分 奔跑一次 3級 20分 奔跑二次 4級 30分 奔跑一次，驚厥一次 5級 40分 奔跑二次，驚厥一次 （3）戊四唑驚厥法 戊四唑為中樞興奮藥，過量興奮和脊髓，表現強烈的陣攣行驚厥，繼續發展為強 直性驚厥。 l 戊四唑發作閾值試驗（小發作模型）：小鼠，SC戊四唑85mg/kg，給藥后5－15 分鐘內發作，頭部及前肢抽搐，但不影響翻正反射。每次可持續5－15秒，可反復發作，少數動物可轉為強直性驚厥而死亡。藥物能夠防止發作，可視為有效。 l 戊四唑最大發作試驗（大發作模型）：將0.5％戊四唑生理鹽水，按38mg/kg于4 秒內尾靜脈快速注射，動物即產生強直性驚厥或死亡。 （4）點燃效應模型 在腦內某些特定的區域受到經常的重復刺激，最終導致腦功能產生某種持久的變化，稱為“點燃效應”。用低電壓或小電流重復刺激大鼠的杏仁核，最終引起驚厥發作。目前是公認的做好的癲癇模型。 l 方法：大鼠麻醉。固定于立體定位儀，將電極埋藏于杏仁核。手術后大鼠休息一 周，然后進行點燃。刺激條件是方形波電壓，波寬1毫秒，頻率60赫茲，刺激持續時間為2秒，每天刺激一次，刺激時間最好相同。刺激電壓從4伏特開始，每刺激2－3天后將電壓升高1－2伏特，每次刺激后注意觀察動物反應并做記錄，記錄內容包括：點燃日期、電壓值、動物的表現等。動物如有靜止不動、單側或雙側閉眼、轉頭、轉圈跑、嘴和面部肌的運動、點頭、前肢陣攣、站立、摔倒等陽性結果。大鼠產生典型發作后，其發作閾值立即下降，此時每天減少次級電壓，當降至某個電壓值剛好引起最大發作，連續刺激3天，該電壓的刺激既能得到穩定的點燃發作效應。此時可利用這個模型進行實驗。 （5）機制分析方法 癲癇發作機制復雜，目前并不知道確切的機制。但與腦內神經遞質、氨基酸、微量元素、神經細胞電活動異常、細胞信號傳導紊亂有關。 l 測定腦內GABA和谷氨酸含量及其合成酶和代謝酶的活性； l 測定腦內各種神經遞質的水平； l 測定cAMP/cGMP的水平； l 測定腦神經細胞的電活動情況。 2. 鎮痛藥實驗 （1）熱板法 （2）扭體法（酒石酸銻鉀，乙酸） （3）光照刺激甩頭法 3. 促智藥和抗癡呆藥研究 早老性癡呆癥又稱阿爾采默?。?/span>Alzheimer disease, AD），AD的臨床癥狀主要是記憶障礙、認知功能缺失及癡呆。病理學特征是腦中發現老年斑（senile plaque）、神經纖維纏結（neurofibrillary tangles）及選擇性神經元死亡。受影響的區域主要有大腦皮層、海馬、杏仁核、基底前腦膽堿能系統及腦干單胺類神經核團。AD的病因至今還未有結論性闡明，目前研究認為主要是腦神經細胞退行性病變機制如氧化應激機制、線粒體機能障礙機制、興奮性毒性機制、炎癥機制及細胞凋亡機制等。它們之間相互影響，最終導致神經功能失調和細胞死亡。 （1）對早老性癡呆動物模型的實驗研究： l 對東莨菪堿、D-半乳糖誘致動物學習記憶障礙的影響 l 對結扎動物雙側頸總動脈誘致血管性癡呆的影響 l 對大鼠或小鼠腦缺血再灌注損傷致學習記憶障礙的影響 l 對大鼠海馬內微量注射β-淀粉樣蛋白（Aβ25-35）建立的癡呆模型的作用 l 檢測方法：采用小鼠穿梭實驗，Morris水迷宮，跳臺法，避暗法及自主活動的測定等方法。 （2）對神經細胞退行性改變的啟動因子抑制作用的研究 l 對抗Aβ注射動物腦細胞凋亡的作用（觀測指標：DNA電泳梯度形成，bcl-2表達下調，bax、P53、C-fox表達上調及APP過度表達等） l 抗氧化應激作用（腦細胞內nNOS、LPO、SOD、GSH-px酶活性的測定和脂褐素的測定） l 抗炎性細胞因子的作用（測定腦細胞內IL-1、IL-4和IL-6的變化） （3）對AD發生相關酶活性的影響（檢測腦細胞內Ach-E，MAO，Na+,K+-ATPase的活性） （4）藥物對腦組織核酸代謝的影響 （5）藥物對腦海馬細胞神經電活動的影響（采用膜片嵌技術） 4. 抗抑郁藥研究方法： （1）利血平拮抗：利血平耗竭腦內CA類遞質（NA、Adr、DA和5-HT），引起動物行為和生理上的變化，表現為：眼瞼下垂，體溫下降及強直癥狀。藥物能夠改善或拮抗上述癥狀，可能具有改善抑郁的作用。 （2）“行為絕望”模型：將動物（大鼠或小鼠）放入一定水深的裝置內，預試15min后，烤干，重新放入，測定動物在該裝置內5min內漂浮不動的時間。評價藥物對其改善作用。 （3）獲得性無助模型：動物可選用大鼠，將動物置于無法逃避的應激刺激（如電擊）時，將隨后產生操作欠佳，而在同等的可以逃避的應激刺激下則不產生操作欠佳?？挂钟羲幙梢阅孓D。 （4）腦內神經遞質變化的測定。
（三）平喘藥物研究方法 1. 鎮咳實驗：采用豚鼠枸櫞酸引咳法、貓二甲基苯基哌嗪引咳法，根據實驗結果分析藥物的鎮咳作用。 2. 平喘實驗：選擇整體動物藥物引喘法，即將引喘藥物 0.1%組織胺和2%乙酰膽堿以氣霧法給予豚鼠引起支氣管痙攣、窒息，觀察藥物的支氣管平滑肌松弛作用。 3. 祛痰實驗： 小鼠腹腔注射0.25%苯酚紅溶液 0.7ml/只，30分鐘后將動物處死。分離氣管，以5%碳酸氫鈉沖洗3次（0.4ml/次），合并沖洗液進行比色，觀察藥物的祛痰作用。
（四）潰瘍病藥物研究方法 1. Shay幽門結扎型潰瘍：結扎幽門造成胃液在胃中滯留，致潰瘍因素增多，導致潰瘍形成。以潰瘍指數（根據潰瘍面積確定）評價藥物作用。 2. 應激型潰瘍：應激刺激使中樞興奮和抑制過程失調，植物神經紊亂，迷走張力過高，胃肌強烈收縮，壓迫胃部血管，引起繼發性粘膜血運障礙，形成潰瘍。一般將大鼠放入冷水中（230C）浸泡7小時，處死動物，取出胃，測定潰瘍指數，進行比較。 3. 損傷型潰瘍：大鼠麻醉后，打開腹部，暴露胃，采用乙酸注射法或乙酸涂抹法，使組織受損產生潰瘍。此模型多用于研究藥物對慢性潰瘍的治療評價。 4. 藥物誘發型潰瘍：消炎痛、阿司匹林、利血平、組胺等。
（五）抗腫瘤藥物的研究方法 1. 藥物體內抗腫瘤實驗：腹水瘤和實體腫瘤的接種，以生命延長率和腫瘤抑制率評價藥物的作用。 2. 腫瘤細胞體外培養試驗法： （1）細胞排染試驗（臺盼蘭染色法） （2）標記代謝物前體摻入法：標記氨基酸摻入蛋白質和標記胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷摻入核酸的測定。 3. 利用分子生物學方法，研究腫瘤發生機制和抗腫瘤藥物的作用點。 （1）拓撲異構酶（TOPO）抑制劑 （2）微管蛋白活性抑制劑 （3）胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成酶(TS)抑制劑 （4）以細胞信號轉導分子為靶點的抗腫瘤藥物（絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路） （5）蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制劑 （6）法尼基轉移酶(FTase)抑制劑 （7）腫瘤新生血管生成（TA）抑制劑 （8）端粒酶抑制劑
（六）保肝藥物研究方法 1. 四氯化碳肝郁脾虛造型法：肝郁脾虛是由于肝氣郁結，蔬泄功能障礙，導致脾胃消化功能紊亂，出現脅痛、厭食、腹脹、大便溏泄、四肢倦怠等脾虛癥狀。四氯化碳中毒有類似情況，因為四氯化碳在內質網迅速被代謝為毒性產物（游離基），使肝細胞膜發生過氧化作用而破壞。因此導致細胞內酶和電介質丟失，大量轉氨酶逸入血清。并進一步影響亞細胞結構。 操作方法： l 10％四氯化碳糠油溶液0.1ml/10g體重給予小鼠皮下注射，于實驗第1天及第6天注 射，第8天處死動物觀察； l 10％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g體重給予大鼠皮下注射，于實驗第1天及第4 天注射，形成急性中毒，第6天處死動物觀察；慢性中毒以10％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g體重給予大鼠皮下注射，每周兩次，共四周，首劑加倍。 l 觀察指征：一般情況比較如活動情況、掙扎力、24小時進食量/只、體重增減、糞便 硬度和顏色等；肝組織變化如肝細胞的松變、氣球樣變、脂變、壞死、再生等以及炎細胞浸潤、結締組織增生、肝竇擴大等。血清學測定SGPT的變化。 2. D-氨基半乳糖法：D-氨基半乳糖肝損傷的病理變化與人類病毒性肝炎病理變化極為相似。它引起肝臟門脈區域的壞死和炎癥浸潤，伴有康西耳曼氏體的有絲分裂和細胞增殖，以及枯否氏細胞數增加，SGPT升高，血清總蛋白降低。以此作為指標評價藥物的作用。 3. 小鼠免疫性肝損傷模型：小鼠注射丙酸桿菌或卡介苗(BCG)后，再注射微量脂多糖(LPS)，可導致嚴重的肝損傷。實驗中可見血中GPT和GOT明顯升高，血清一氧化氮也明顯升高，肝臟病理檢查以肉芽腫性炎癥浸潤為主。觀察藥物對這些指標的影響。
（七）降糖藥物研究方法 1. 鏈脲霉素(STZ)誘致糖尿病模型：STZ結構中的亞硝基脲是細胞毒。STZ 的α-異構體有較高的毒性,可能與B細胞膜上的葡萄糖受體有較高的親和力。STZ通過自由基損傷B 細胞，使細胞內胰島素合成受損，造成胰島素缺乏。 l 方法：將STZ溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液中，臨用前配制。大鼠常用量為60－ 80mg/kg(iv或ip)，小鼠為100－200mg/kg(iv或ip)。 l 結果：注射STZ后72小時，血糖可穩定升高，預測血糖在11.1mmol/L以上時可選 用。給小鼠連續5天注射小劑量STZ（35－40mg/kg），1－2周后引起胰島炎。 2. 四氧嘧啶（Alloxan）誘致糖尿病模型：Alloxan是胰島B細胞膜毒劑，通過產生超氧自由基而破壞B 細胞，使細胞內DNA損傷，并激活多聚ADP核糖體合成酶活性，從而使輔酶Ⅰ含量下降，導致mRNA功能受損，B 細胞合成前胰島素減少，導致胰島素缺乏。 l 方法：
l 結果：注射Alloxan72小時后，血糖可穩定升高，預測血糖在11.1mmol/L以上者可 選用。 三、小結 中藥藥理研究的方法很多，根據選擇的題目和要解決的問題確定合適的方法。但最重要的是選擇的方法一定要可靠、穩定和可操作性。實驗前的實驗設計非常重要，要三思而后行，避免悔之晚矣！這里介紹的幾種實驗方法僅供參考，具體操作時還要查閱有關的書籍和文獻，并有必要的進行預實驗，掌握第一手資料。 參考文獻： 1. 李儀奎主編：中藥藥理實驗方法學. 上?？茖W技術出版社，1991 2. 張均田主編：現代藥理實驗方法（上、下冊）.北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998 3. 杜冠華等主編：藥理學實驗指南－新藥發現和藥理學評價.科學出版社，2001
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