植物化學成分分析

最近幾年，植物化學這門學科已發展成為天然產物有機化學和植物生物化學之間的一門專門學科，并且同這兩方面緊密關聯。植物化學涉及大量的由植物精制和積累起來的各種各樣的有機物質，它研究這些物質的化學結構、合成、轉化和代謝、天然分布及其生物學功能。  所有這些工作，均需要分離、純化和鑒定植物中存在的許多不同成分的方法。因而，我們所了解的植物化學的進展，是與已有技術的成功開發，以及不斷發展解決植物化學中出現的突出問題的新技術直接相關。植物化學的挑戰之一是用極少的材料進行上述所有操作所有操作。生物學問題，譬如植物生長調節作用、植物—動物相互作用的生物化學、或者了解化石植物的起源等問題的解決，常常取決于鑒定一系列只能用微克量級研究的復雜的化學結構。  本書的目的是首次提供目前可以利用的植物物質的分析方法入門，提供有關該學科文獻的一把鑰匙。這里所敘述的方法并無新奇之處。實際上，其目的是概述已經最廣泛采用的那些方法，這樣，學生和研究工作者可以最快地發展自己的技術，以解決自己的問題。  我們采用一些簡單的化學實驗室技術訓練作基礎，因為許多技術簡單而又明了，對于化學知識很少的植物學家和其他植物科學家來說，是能夠從事植物化學工作的。從事其它實際課題的研究時，學生們必須發展自己的經驗。沒有什么準確地寫下來的處方，可以代替平時實驗室的常識和由基本原理進行思考的能力。隨后的大部分章節提供一些實際的實驗例子，通過這些實驗可以獲得工作經驗。它們適于作為實驗課程，許多方法早已用于此目的。  植物產生的各種分子結構的范圍和數目是巨大的，我們現有的有關植物成分的知識進展是如此之快，以致植物化學研究的一個主要問題是核對有關每一類特殊化合物的資料。例如，曾經估計過，目前已知有5500種以上的植物生物堿。由于醫藥上對新奇生物堿的興趣如此之大，以致于這種新生物堿可能正以每天一個的速度被發現和描述。

   由于已知物質的數目是相當之大，因此在本書的每一章中均作了專門介紹，指出在每類化合物之內存在的結構的多樣化，扼要說明那些普遍存在的化合物并說明具有代表性的分子式的化學多樣性。盡可能列出每類已知化合物的最新文獻，包括大多數最普遍的植物成分的RF值、顯色反應以及特殊性質的表。這些表主要是說明性的或作比較之用，并不詳盡。 

從植物中篩選化學物質的快速而精密的方法的發展，大大有助于植物化學的進展。因此本的側重點放在層析技術上。這些方法已經表明，許多原來認為相當稀有的物質，在植物界卻幾乎普遍存在。植物的生物學活性物質的連續調查的重要性無需強調。當然，在隨后的各章中相當詳細地討論特殊化合物類的初步檢測方法。 

雖然“植物”一詞在這里指的是植物界這個整體，但側重于高等植物，而對微生物的分析方法不詳細討論。作為一般的原則，鑒定高等植物中的生物堿、氨基酸、醌類和萜類所用的方法亦可直接用于微生物系統。在許多情況下，分離要容易得多，因為通常不存在諸如單寧和葉綠色這樣的雜質。在少數情況下，分離可能比較困難，由于微生物細胞有彈性因而需要采用機械破碎以釋放出存在的某些物質。 

由于篇幅的限制，有許多在微生物中發現的有機化合物如青霉素（Penicillin）和四環素（tetracycline）抗菌素（Turner，1971；Turner和Aldridge，1983），它們的鑒定不包括在內。地衣類亦制造一系列特殊的色素，包括縮酚酸環醚和縮酚（羧）酸類。這些化合物根據其顯色反應，層析和光譜技術等特殊的微量化學方法進行分析。Culberson（1969）對地衣化學做出了全面的闡明。地衣色素在第二章中將簡單地敘述。 

植物的化學成分可以用許多不同的方法分類。本書是根據生物合成來源、溶解度性質以及存在某些關鍵的官能團分類。第二張講述酚型化合物，是一類根據其親水性以及其共同親源于芳香族的前體莽草酸(Shikimic acid）而很容易辨認的物質。第三章討論萜類，它們均具有酯類性質，其生物合成來源為異戊烯焦磷酸（ isopentenyl Pyrophosphate）。第四張專述有

   機酸、脂質以及由乙酸酯生物合成而獲得的其它化合物。第五章為植物氮的化合物，以對水合茚三酮（ninhydrin）或Dragendorff試劑（將次硝酸鉍1.5克懸浮于20ml熱水中，加入碘化鉀7克及稀鹽酸20滴而成）的陽性反應辨認的堿性物質。第六章涉及水溶性碳水化合物及其衍生物。最后，第七章主要包括植物的大分子即核酸、蛋白質和多糖，這些化合物以及高分子量容易同其它成分分開。 

在引論這章的其余部分，概括地討論提取、分離和鑒定的方法。最后一節包括植物化學方法應用于不同植物科學領域的一些例子。 

可以利用的有關植物分析方法的主要參考資料為Peach和Tracey(1958-1984)主編的、用英文和德文寫作的七卷論文，這部著作現在雖然已顯過時，但可供作本學科必要的基礎讀物。涉及植物化學方法的許多其它教科書，列在本章及以后各章末尾的參考文獻中?？梢圆殚喌挠嘘P最新技術的雜志《層析雜志》（Journal of Chromatography)，《植物化學》(Phytochemistry)，《分析生物化學》(Analytical Biochemistry)，《層析科學雜志》(Journal of Chromatographic Science)和《植物學》(Planta)。 

1.2 提取和分離 

1.2.1 植物材料 

最理想的植物材料應采用新鮮的植物組織，且材料應在收集的幾分鐘內浸入沸乙醇中。有時候，手頭沒有要研究的植物，材料可能要由住在另一個大陸的收集家供應。在這種情況下，將新鮮采摘的組織干藏在塑料袋中，在幾天的航空郵寄的時間內，通產能保持良好的分析條件。 

或者，可在提取之前將植物干燥。干燥操作必須在控制的條件下進行，以避免太多的化學變化發生。應盡早可能快地干燥，不用高溫，可用一臺質量好的風干機風干。植物一旦完全干燥之后，即可在分析之前長時間儲藏。確實，許多年前曾成功地用標本的植物組織進行類黃酮、生物堿、醌類和萜類的分析。 

利用標本材料的一個例子是精油的分析，其材料是薄荷葉的模式標本，它是1800年前林奈（Linneaus）的原始采集獲得的(Harley 和Bell，1967）。在葉和果實組織中，精油的含量可能隨時間發生變化，這種可能性必須考慮到。例如，Sanford和Heing（1971）發現，肉豆蔻果中的肉豆蔻醚（myristicin）的含量在儲藏時慢慢地增加，而揮發性較大的β-蒎烯（β-Pinene）的含量卻隨時間的推移而降低。另一方面，雖然時間推移，植物標本中的類黃酮和生物堿卻相當穩定，如原來在1675年采集的馬錢子（Strychnos nuxvomica）的葉樣品仍含有1-2%重量的生物堿（Phillipson，1982）。 

顯而易見，必須注意把所研究的植物組織同其它混雜的植物分開。例如，要采用無病的植物，即不受病毒、微生物或真菌感染影響的植物。因為在這樣的植物中，不僅可能檢出微生物的合成產物，而且感染還可能嚴重地改變植物的代謝，可能大量地產生預料不到的產物。 

在收集低等植物材料做分析時，亦能產生混雜現象。采集寄生在樹上的真菌時，重要的是除去樣品中的所有樹木組織。由于污染的緣故，早期有關兩種真菌中綠原酸(Chlorogenic acid）（一種典型的高等植物產物）的報告幾乎可以肯定是不正確的（Paris等，1950）。在小心弄干凈后的材料商做重復分析并沒有顯示該化合物存在的證據(Harbone，J.B.和Hora，F.B.，未發表的結果）。苔蘚類（mosses)常常與高等植物緊密結合生長，因此，要得到沒有枯枝層混雜的苔蘚有時是件難事。最后，可能被不正確地認為是同一種，或者可能采集了一種植物而沒有覺察到有一種寄生物（諸如菟絲子，Cuscuta epithimum）與它糾纏在一起。 

在植物化學分析中，所研究的植物學鑒定，必須由其中某一研究時期所公認的權威確證。過去在植物鑒定方面出了這么多的錯誤，所以無論報道植物的新物質，還是報道新植物來源的已知物質，必不可少的是確證其材料。材料的鑒定應當是無可爭辯的（例如由一個野外工作的植物學家在預期的生境采集的一個普通種），或者應盡可能由分類學家證實其鑒定。為此，目前植物化學研究中的普遍慣例是在一個公認的植物標本室，存放所研究的經證實的植物標本，以便將來需要時，作為研究該植物的進一步參考。 

1.2.2 提取 

正確的提取方法自然取決于被提取的植物材料的構成和含水量，取決于被分離的物質的類型。一般地說，需要把植物組織“殺死”，即防止酶的氧化作用或水解作用發生。把新鮮的葉或花組織（有必要時適當地切碎）投入沸乙醇中是達到這個目的的好方法?？傊?，任何情況下乙醇用于初步提取是一種良好的全效型溶劑。隨后，將材料置于搗碎器中浸解并過濾；但這種方法只有打算完全提取時才有必要。從綠色組織分離物質時，醇提取的成效與進入溶劑的葉綠素的量直接相關。當反復提取至組織碎片無綠色時，可以認為，所有低分子量的化合物都已提取完畢。 

從植物干組織（心材、干種子、根、葉）獲得有機成分的經典化學方法是，在索氏提取器中，用一系列溶劑連續提取經粉碎了的材料；開始一次用乙醚、石油醚和氯仿提?。ǚ蛛x脂肪和萜類），然后用乙醇和乙酸乙酯提?。O性較大的化合物）。在克量級操作時，此方法是有用的；但是，人們很少達到成分的完全分離，同樣的成分可見于（不同比例）幾種不同溶劑提取的組分中。 

將提取液通過硅藻土，用水泵抽濾凈化，然后真空濃縮。現在常用旋轉蒸發器進行濃縮，它能在不太強烈的條件（即在30℃-40℃溫度）下，把大體積的溶液濃縮為小體積。從植物中提取揮發性成分要特別小心，這些將在第三章討論。 

人們通過實踐，可以簡化提取步驟。例如，從葉組織中分離水溶性組分時，嚴格地說，應在濃縮前用石油醚反復洗滌水提取物以除去其中的脂類化合物。實際上，將乙醇提取液直接在旋轉蒸發器中濃縮時，幾乎所有的葉綠素和脂類物質均沉積在燒瓶的壁上。在熟練時，濃縮恰到好處，這時用導管吸出水濃縮液，則幾乎可完全地除去脂類雜質。 

濃縮后的提取液放置時可能吸出結晶，如是，過濾收集結晶，并用幾種溶劑進行層析檢驗其均一性（見下一節）

如果為單一物質，則此結晶經重結晶純化，即可用于進一步分析。在大多數情況下，結晶中可能存在一些物質的混合物，這樣就有必要把它們重新溶于一種適當的容積，用層析法將其成分分開。在結晶母液中亦保留許多化合物，這些化合物亦應層析分類。預防物質損失的一個標準方法是將濃縮過的提取液儲藏在冰箱中，并加入痕量的甲苯以防止霉菌生長。 

研究一個指標的植物種的植物化學全貌時，粗提取物的分部是必要的，以便在層析前將主要幾類成分彼此分開。圖1-1中所示是根據成分的極性不同分離的一個程序，它可應用于含生物堿的植物的成分分離。當然，分離到不同部分中的化合物的數量與類型，將因植物不同而異。還有，當研究不穩定物質時，這程序可能要做些變動。 

1.3分離方法 

1.3.1一般方法 

植物成分的分離和提純主要是采用四種層析技術即紙層析、薄層層析、氣液色譜和高效液相色譜中的一種或結合進行的。技術的選擇大大地依賴于被分離的化合物的溶解性和揮發性。紙層析法特別可用于水溶性的植物成分，及碳水化合物、氨基酸、核酸堿基、有機酸及酚型化合物。薄層層析是分離所有脂溶性化合物（即脂類、甾族化合物、類胡蘿卜素、簡單的醌和葉綠素）所選用的方法。相反，第三種技術即氣液色譜主要應用于分離揮發性化合物——脂肪酸、單萜和倍半萜類、烴類及硫的化合物。但是，把高沸點的植物成分轉化為酯和三甲基硅醚可以增進其發揮性，因此沒有幾類化合物是完全不適合氣液層析分離的。揮發性低的成分還可以用高效液相色譜分離，這是一種兼具柱效率和分析速度的分離方法。此外還應指出，可以適當地交叉使用上述技術，通常是將紙層析與薄層層析、薄層層析與高效液相色譜、或薄層層析與氣液色譜結合使用，這可能是分離某類植物成分的最好方法。 

上述技術微量和大量均可使用。制備分離時可在一厚度的吸附劑上進行薄層層析，在一張厚濾紙上進行紙層析。要分離更大量的樣品時，通常采用配有自動分部收集的柱層析，這種方法能制備克量級的純化合物。 

電泳是植物化學中應用相當廣泛的一種更進一步的技術。起初，這種技術只應用于帶電荷的化合物，及氨基酸、一些生物堿、胺類、有機酸和蛋白質。但是，還有一些中性化合物（糖類，酚類），轉化為金屬復合物（例如用Na3BO3）即能在電場中移動。Sargent(1969)對電泳技術做了簡單的介紹。 

除了已述的技術外，在植物化學研究中，偶爾還采用其它一些技術。用簡單的液-液萃取分離，在類胡蘿卜素的分離分析方面仍有價值（第3章）。有時也可采用自動的液-液萃取方法，如用Craig所設計的反流分配（逆流分容）裝置，但它只是在其它技術失敗時，被作為最后的手段。最近已發展了一套更方便的液-液萃取裝置，即所謂的點滴反流層析（DCCC），它主要應用于水溶性成分的制備量分離（Hostettmann，1981）。植物蛋白質和核酸的分離常常需要采用這里尚未提到的特殊技術，如Sephadex（葡聚糖）凝膠過濾、親和層系和差速超離心等等。 

因為有關層析法技術已有眾多的著述（見Heftmann，1983等），因此在這里僅需討論一下應用于植物化學研究的那些主要分離技術，并給出一些其它有用教科書的有關的參考文獻。 

1.3.2紙層析 

紙層析的主要優點之一是非常方便，即簡單地在濾紙條上進行分離，濾紙既作分離介質，又作載體。另一優點是紙上測定的RF值重現性好，因此它是闡明新的植物化合物的有價值的參數。確實，對于諸如花青苷（anthocyanins）這類無其它明顯特征的物理性質的物質，其RF值是描述和鑒別各種不同色素的最重要方法（Harborne，1967）。 

紙層析通常包括分配層析和吸附層系。在分配層析中，化合物在水不溶混的醇溶劑（例如正丁醇）和水之間分配。經典的混合溶劑正丁醇-乙酸-水（4：1：5，頂層）（縮寫為BAW）被設計作為增加正丁醇層的水含量的一種方法，因而改善了溶劑混合物的利用率。確實，BAW仍廣泛作為許多類植物成分的一般溶劑。相反，吸附力是在水性溶劑中紙層析的主要特性之一。純水是一種值得注意的通用層析溶劑，它一般可用來分離普通的嘌呤類和嘧啶類，亦可應用于酚類和植物糖苷類的分離。 

紙層析裝置的選擇，在某些程度上取決于可利用的實驗室空間的大小。例如，水平的或圓形的紙層析所占得空間要比標準的薄層層析槽稍微大些，其分辨率相當高，因而被用來分離類胡蘿卜素類化合物。在大多數實驗室中，紙層析以下行法進行，槽中濾紙的大小為46×57㎝（Whatman濾紙）。下行法紙層析是最有用的，因為必要時易于讓溶劑跑過頭。它對雙向分離亦較方便些。 

一系列重要的“改良的”商品濾紙可用于完成特殊的層析分離。例如將硅膠或氧化鋁摻入紙中可以降低纖維素的極性，使濾紙較適合于分離脂類、濾紙也可以在實驗室中改良，例如，把它們浸漬在石蠟或硅油中，便可以“逆相”層析分離脂類。大量分離可以用厚層濾紙（Whatman3號或3MM紙），這種濾紙每張可以分離幾毫克的物質。 

在紙層析中，化合物的檢測通常是用一種生色試劑噴霧或浸漬，使之與被檢測的化合物反應生成有色的或紫外熒光斑點。大張濾紙，浸漬通常容易些，但其噴霧溶劑量應當改進，以利快干，這樣可避免浸漬時的擴散作用。然后可將濾紙加熱使之顯色。 

RF值是一種化合物在層析時相對于溶劑前沿的移動距離。它由以下方法測得：測量原點到該物質產生的斑點中心的距離，此距離除以原點到溶劑前沿的距離（即溶劑移動的距離）。 

RF值總是一個分數，其數值在0.01和0.99之間。為方便起見，常將RF值乘以100.本書所引用的RF均為RF（×100）。另外有時把RF（×100）稱為hRF值。 

比較一系列結構上相關的化合物的RF值時，指定另一個層析參數即RM值是有用的，它和RF的關系用下式表示： 

)1R1

log(RFM?? 

此式在表達層析遷移率同化學結構關系方面很有價值，因為在同系列中，△RM值通常是常數。以黃酮類化合物為例，對分子中存在的羥基和糖基取代數目來說，△RM是個常數（BateSmith和Westall，1956）。這一方法可用來計算一系列化合物中的未知成員的RF值，有利于檢查植物提取液的特殊化合物。例如，采用這樣的方法表征一種新的莰非醇甲醚時，預測的（理論值）和實驗的RF值非常一致（表1-1）（Harborne，1969）。 

在大量有關紙層析的文獻中，Peereboom（1971）所寫的介紹性文章對初學者是有用的。Lederer和Lederer（1957），Linskens（1959）及Sherma和Zweig（1971）等人所著有關紙層析的書，是有特殊價值的RF數據來源。 

1.3.3 薄層層析 同紙層析相比，薄層層析的特別優點是多用型，速度和靈敏度。多用性是由于纖維素外，還可以把許多不同的吸附劑涂布在玻板上或其它載體上而用于層析。雖然硅膠使用得最廣泛，但板層可以由氧化鋁、硅藻土、氫氧化鈣、離子交換樹脂、磷酸鎂、聚酰胺、Sephadex（葡聚糖凝膠）、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、以及上述兩種或兩種以上物質的混合物組成。薄層層析的速度較快是由于涂布在玻板上的吸附劑比較緊密，分離不穩定的化合物時，速度快是個優點。最后，薄層層析的靈敏度較高，必要時可以完成小于微克量物質的分離。 

薄層層析原先的缺點之一是吸附劑涂板很費勁。幾年前，由于引入自動涂布機而減輕了勞動。盡管如此，仍需小心操作。玻璃板必須小心用丙酮清洗以除去油脂。其次，水調和的硅膠漿（或其它吸附劑）在涂布之前必須劇烈振蕩一定的時間間隔（例如90秒）。根據吸附劑的顆粒大小，可能需要添加硫酸鈣半水合物（15%）幫助吸附劑粘固在玻板上。最后，將涂布后的板層風干，然后在100-110℃的烘箱中加熱活化30分鐘。在某些分離中，以加無機鹽來（例如加AgNO3進行銀化薄層層析）改良吸附劑的性質，最好在涂板時加入。在實驗室仍然使用涂布的層析板的另一個原因是可以控制硅膠的濕度，這是一些分析的關鍵因素。 

但是，新近在大多數工作中通常采用廠商生產的預涂板，因為這些板比較一致，因為能提供重現性較好的結果。有一系列的商品板可以使用，以不同的吸附劑涂布在玻板、鋁板或塑膠板上。這些板可能含或不含熒光指示劑。含熒光指示劑的板可用于那些能使熒光焠滅的化合物，在254nm的紫外光下照射即可檢測。最新類型的薄層層析板是用微粒硅膠涂制的，這種板層的硅膠顆粒與高效液相色譜柱中使用得一樣細。這種層析法稱為高效薄層層析（HPTLC），用其分離通常比普通的硅膠層更有效和更快速。 

已用于薄層層析的溶劑比應用于紙層析的溶劑范圍更廣泛，而且，一般地說，在一個溶劑系統中采用不同溶劑的精確比例有更大的幅度，但RF值的重現性比紙層析差得多，因此必須有一個或多個的參考化合物作為標準物質。精確測量薄層層析的RF值的條件標準化是可能的，但是，這是一個很煩瑣的過程。薄層層析通常在一個有紙襯里的槽中以上行法進行，因此槽內的氣相被溶劑相飽和。當層析板需要用溶劑溢流或采用薄層層析-電泳結合時，可采用水平的薄層層析。 

薄層層析板上的化合物通常用噴霧法檢測。板的面積較?。?0×20㎝），使這種方法相對地簡單。玻璃板可以用濃硫酸噴霧，這比紙層析優越。濃硫酸是檢測甾族化合物和脂質的有效試劑。 

制備薄層層析采用厚層吸附劑（厚達1mm）代替薄層吸附劑（0.10-0.25mm）?？捎蒙唐钒?。將已展開的板上的適當位置的吸附劑刮下來，用溶劑（如乙醚）洗滌這些粉末，最后離心除去吸附劑，則可回收已分離的成分。玻板上吸附劑的強度很大，所以一片板能夠用一種或幾種不同溶劑系統反復展開（兩次展開之間要先干燥）?；蛘呖梢允褂肰an Sumere（1969）設計的多次消去（multiple elimination)薄層層析系統。這種系統包括一個復雜分離的適當階段，用玻璃刀切下一長條涂有吸附劑的長方型玻璃，在兩次分離之間，把新鮮的吸附劑噴灑在這塊板上。在下述的有關薄層層析的書中，敘述了許多其它改進方法。 

有關薄層層析的文獻非常龐大。Stahl（1969）編輯的書最具綜合性。Truter （1963）編寫了一本簡單的引論。其它重要的書有Bobbitt（1963）、Kircher（1978）及Touchstone和Dobbins（1978）的著作。 

1.3.4 氣液色譜法 

同紙層析和薄層層析相比，氣液色譜所需的裝置較高級且昂貴。但在原理上，氣液色譜并不比層析方法復雜。 

氣液色譜的儀器裝置有如下四個主要部件： 

（1）柱 通常為一根窄長（如3m×1mm）的金屬管，完成蛇形以減少空間。柱中充填涂在惰性粉末（如硅藻土、火磚載體W等）上的固定相（如5-15%硅油）。不一定用填充的柱，也可以采用開放的硅膠柱，在這種柱中，固定相是涂在內表面的一層薄膜（毛細管氣液色譜）。 

（2）加熱色譜柱的加熱器。必要的話，柱溫以一標準的速率從50℃逐漸升高到350℃并保持在高溫限的溫度上。柱入口的溫度單獨控制，以便使樣品一進入柱即迅速汽化。溶于乙醚或己烷的樣品用一支皮下注射器穿過橡皮隔膜注入入口處。 

（3）氣流由氮氣和氬氣等惰性載氣組成。這些氣體以控制的速率通過層析柱，使化合物在柱上分離。 

（4）化合物通過柱時，需要檢測裝置測量。檢測常常以火焰電離和電子捕獲的原理為基礎。前一種方法需要在氣體混合物中加入氫氣，并在實際的檢測其中燒盡。檢測器連接一臺電位測量記錄儀，記錄儀以一系列強度不同的峰記錄分離的結果（圖1.2）。

   

   氣液色譜的結果可以用保留體積RV這個術語來表示，RV為從柱上洗脫一個組分所需的載氣的體積；或者用保留時間Rt表示，Rt為洗脫樣品所需的時間。這些參數幾乎總是以一個相對于一種標準化合物的術語（如RRV或RRt）表示。標準化合物可以加到樣品提取液中，或者作為溶解樣品的溶劑加入。 

氣相色譜的主要可變量是柱的固定相的性質和操作溫度，這兩個條件隨被分離的化合物的極性和揮發性不同而變化。按常規，許多物質在進行氣液色譜測定之前被轉化為衍生物（特別是轉化為三甲基硅醚），因為這樣能在較低的溫度下分離。 

氣液色譜提供有關植物物質的定性和定量數據，因為測量氣液色譜軌跡（圖1.2）所顯示的峰面積與原始混合物中不同組分的濃度直接相關。有兩個測量這些峰面積的一般公式：（a）峰高×半峰高處的峰寬=94%的峰面積（這只適應于對稱峰；（b）峰面積等于通過折點引切線所圍成的三角形面積。峰面積可以自動測量，例如使用電子積分儀測量。 

氣液色譜儀可以與其它分析系統連接，使被分離的成分進一步進行光譜分析或其他成分。氣象色譜儀最常與質譜測定自動連接。色譜-質譜（GS-MS）聯用儀近年來已作為所有植物化學分析技術中最重要的技術之一。 

雖然有許多有關氣液色譜的書和評論文章，但為從事植物化學工作的讀者寫的卻寥寥無幾。從實踐的觀點出發，Simpson（1970）的著作是一本有用的引論性教科書，Burehfield和Storrs（1962）的著作是一本涉及氣液色譜的生化應用更專業的參考書。 

1.3.5高效液相色譜（HPLC） 

高效液相色譜在其靈敏度及一次操作即能提供定性和定量方面類似于氣相色譜，差別在于鍵合到多孔聚合物上的固定相系統裝在窄徑不銹鋼柱中，而液體流動相在相當大的壓力下強力通過。高效液相色譜儀比氣相色譜儀更貴，主要是需要一個合適的壓力泵系統，所有連接必須用螺絲以承受內在的壓力。流動相是可混溶的溶劑混合物，其比例或者保持恒定（常液分離），或者利用一個溶劑混合室連續改變其比例（梯度洗脫），用檢測器監測從柱中洗脫的化合物，通常測定其紫外光吸收。且配上一臺積分儀處理測定的數據，全部操作可通過一臺微處理機控制。 

高效液相色譜與氣液色譜的主要區別在于，前者在正常室溫下操作。因此，分離時不會出現化合物熱重排的可能性。但是，對于精密分離，控制高效液相色譜柱的溫度可能是有益的。因此需要一個恒溫控制的夾套。層析柱通常裝填顆粒很小的硅膠，硅膠上涂著或鍵合上固定相。它對雜質中毒特別敏感，因此，在樣品注射入柱頭之前，將植物提取液提純和過濾是必需的工作。 

高效液相色譜主要用于非揮發性化合物的分析，即高級萜類、所有類型的酚型化合物、生物堿、脂質和糖類。在紫外和可見光譜區可檢測的化合物，其工作最佳。圖1.3是以高效液相色譜分離黃酮類化合物的一個例子。糖類在紫外光區沒有任何吸收，可用折射率檢測器，但這是一個低靈敏度的方法。蛋白質的分離已用改良的葡聚糖凝膠，硅膠或離子交換劑柱的高效液相色譜進行。 

在最現代化的高效液相色譜分離中采用預裝柱，且有許多類型預裝柱商品可以使用。但是，利用硅膠微孔顆粒柱（對非極性化合物）或逆相C18鍵合相柱（對極性化合物）進行大多數分離是可能的（Hamilton和Sewell，1982）。這里有必要提及一個實驗細節，即溶劑必須是超純的，用前必須除氣。 

高效液相色譜是加入植物化學家工具庫最晚的一項層析技術。除了儀器和溶劑的昂貴之外，它是植物成分定量分析的最重要的和通用的方法，不過尚有待證明它也可用于制備量分離。

1.4鑒定方法 

1.4.1 一般方法 

在鑒定一種剛分離提純的植物成分時，首先必須確定它是屬于哪一類的化合物，然后找出它是這一類中的某一種物質。必須預先小心檢查樣品的均一性，即在幾種薄層層析和（或）紙層析系統中移動均顯示單一斑點。從化合物對顯色試驗的反應、溶解度、RF性質及其紫外光譜的特征，通常能夠明顯看出化合物的種類。生化試驗也是非常寶貴的：糖苷的存在可以用β-葡糖苷酶水解確證，如芥子油糖苷的存在可以用黑芥子硫苷酶（myrosinase）水解確證等等。對于生長調節劑，生物測定是鑒定的一個必不可少的部分。 

同一類化合物內的完全鑒定依賴于測量其它性質，并將這些數據與文獻中的有關數據加以比較。這些性質包括熔點（固體）、沸點（液體）、旋光度（光化學活性物質）和RF值或RRt值（在標準條件下）。但是，光譜特征可以同等提供有關植物物質的數據，包括紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、核磁共振譜（NMR）和質譜(MS）的測定。已知的植物化合物可以在上述的基礎上加以鑒定。應當與可信物質的光譜數據進行直接比較（如可得到）作最后確證。如果無可信物質可以利用，只要仔細與文獻數據比較也能鑒定。如果是一種新的化合物，所有上述數據應當足以表征它。但是，對于新的化合物，通過化學講解或實驗室合成該化合物進行確證更好。 

用X-射線晶體衍射鑒定新的植物化合物，目前已成為常規方法，只要有足夠的物

質且為結晶型就能用這種方法鑒定。對于復雜的萜類化合物，這種方法特別有價值。因此它能以統一操作提供結構和立體化學兩方面的信息。 

   

   現在，我們簡要地評論一下不同的光譜技術以及它們對植物化學鑒定的比較重要性。有關光譜方法的更詳細討論，讀者可以參考許多有關分光光度法在有機化學中的應用的書中之任意一本（Brand和Eglinton，1945；Williams和Flenming，1966；Scheinmann，1970，1974）。 

1.4.2紫外和可見光譜法 

植物成分的吸光光譜可以用自動記錄的分光光度計，以很稀的溶液對溶劑空白進行測量。無色的化合物，可在200-400nm范圍內進行測量；有色的化合物，其測量范圍為200-700nm。記錄所獲得的吸光光譜的最大值和最小值的波長(nm)，并記錄其特殊的最大和最小的吸光光度（或光密度）（圖1.4）。只需痕量的物質，因為標準的風光光度的比色池（1×1cm）只能容納3ml溶液，若使用特殊的比色池，用于分光光度法測定的溶液只需該體積的十分之一。這樣的光譜測量在鑒定許多植物成分方面，在提純植物產物時監測層析柱的洗脫物以及檢查植物粗提液中特定類化合物，諸如多炔存在等方面是重要的。 

紫外光譜法中廣泛采用的溶劑為95%乙醇，因為大多數化合物在乙醇中均有一定的溶解度。應當避免使用市售的無水乙醇，因為它含有殘留的苯，在短紫外光區有吸收。其它常用的溶劑有水、甲醇、己烷、石油醚和乙醚。一般應當避免使用氯仿和吡啶這類溶劑，因為它們在200-260nm 區有強吸收；但是，它們非常適合于植物色素注入累活蘿卜素的可將光譜的測量。 

當物質已分離成結晶化合物，竊分子量已知或可以測定時，波長最大值的強度通常以術語log∈記錄，式中∈=A/cl（A=吸光度，c=濃度，克分子/升，l=比色池光徑長度，通常為1cm）。對于濃度和分子量未知的化合物，必須采用吸光值。在這種情況下，各個最大值的高度可以進行比較，即將相當的吸光度表示為其最強峰的吸光度的百分數。純化是光譜研究的一個基本的準備工作，顯示特征吸光性質的植物成分應當反復提純直到這些性質恒定。層析提純時，濾紙中存在的紫外吸收雜質的吸收，可以制備濾紙的洗脫液（與樣品同時制備）作為空白，這樣就可以消除其影響。用薄層層析板進行純化時應采用類似的步驟。 

在中性溶液中，或者在不同的pH范圍內，或者在特殊的無機鹽存在下，進行反復測量，可以大大地增進光譜測量在鑒定方面的利用率。例如，把堿加到酚型化合物的醇溶液中，其光譜特征地移向長波長（紅移），其吸光值增強（圖1.4）。相反，當堿加到芳香羧酸的中性溶液中其光譜向相反的方向位移，即移向短波長（藍移）。諸如化學還原（用NaBH4）或酶水解這樣的反應，同樣可以再記錄式分光光度計的比色池中進行，在有規則的時間間隔測量其吸收情況，可探明是否發生了還原或水解作用。 

紫外和可見光譜在鑒定未知成分方面的價值，明顯地與光譜的相對復雜性及其波長最大值的一般位置有關。如果一種物質在250-260nm區間顯示單吸收峰，那么這種物質可能是一系列值得考慮的化合物中的任何一個（例如，一種簡單的酚、嘌呤或嘧啶、芳香族氨基酸等等）。但是，如果它在400-500nm區顯示三個可以辨別的峰，在其它地方沒有什么吸收，那么它無疑是類胡蘿卜素。進而，用兩三種其它溶劑測量光譜，并將這些光譜與文獻數據比較，還可以指出它屬于哪一種特殊的類胡蘿卜素。 

上述情況意味著吸收光譜在植物色素研究中具有特別的價值，這一點對水溶的和脂溶的植物生色物質（表1.2）無疑是真實的。其它顯示特征吸收性質的化合物包括不飽和化合物（特別是多炔類）、普通的芳香族化合物（例如羥基肉桂酸）和酮類。完全無紫外吸收也提供某種有用的結構信息，它表明植物提取液的脂溶性部分中存在飽和脂質和烷烴類物質，或指出其水溶性部分中存在有機酸類、脂族氨基酸類或糖類。

    由于篇幅限制，本書只列出有限數目的植物成分的光譜特性，這些性質主要以光譜最大值表格形式記錄，而在后面幾頁還包括光譜曲線的一些說明，比較詳細的光譜數據表參見許多有關的這類數據的專輯，例如Hershenson（1956，1962，1966）或Lang（1959）編輯的數據資料。Gillam和Stern（1957）以及Williams和Fleming（1966）的著作是適用性強的吸收光譜的引論性教科書。專門論述天然產物光譜的更專深的教科書是Scott（1964）的著作。還有一本Morton（1975）寫的生物化學光譜學的綜述性論著。 

1.4.3 紅外光譜法 

植物物質的紅外譜可用自動記錄式紅外分光光度計測量，可用溶液（1-5%）的氯仿溶液或四氯化碳溶液，與醫用潤滑油（nujol oil）研糊，或者用固體，與溴化鉀混合。在后一種情況下，在無水條件下將含1mg樣品和10-100mg溴化鉀的粉劑用模壓制成薄片。測量范圍為4000-667㎝-1（2.5-15μm），記錄一個光譜約需三分鐘。用這種方法獲得的典型的紅外光譜示意圖1.5。 

在高于1200㎝-1的紅外光譜區出現的譜帶或峰，是由所研究的分子內的個別鍵或官能團的振動引起的（表1.3）。在低于1200㎝-1的光譜區出現的譜帶是由整個分子的振動引起的，由于其復雜性，該區就是常說的“指紋”區。各條帶的強度主觀地用簡單的尺度記錄為強（S）、中等（M）或弱（W）。 

許多官能團可以用其特征振動頻率（表1.3）鑒定，這使紅外光譜成為確認化合物類屬的最簡單的且常常又是最可靠的方法。此外，在植物化學研究中，紅外光譜最常被用作“指紋”設計，把天然產物與合成樣品比較（圖1.5）。紅外光譜的復雜性使之特別適宜于這種目的，這種比較在許多植物成分的完全鑒定中是很重要的。例如，紅外光譜已廣泛用來鑒定裝備量的氣液色譜分離的已知香精油成分。

    在圖1.5中給出利用紅外光譜：指紋識別“生物堿的一個說明。采用溴化鉀壓片方法鑒定煙草的兩個痕量成分為哈爾滿堿（harmane）和去甲哈爾滿堿（norharmane）（Poindexter和Carpenter，1962）?？梢钥闯觯瑑蓚€生物堿的指紋區的一些細節在天然樣品中不存在，這可能是由于存在痕量的雜質的結果。還能看到，雖然這兩個生物堿在結構方面非常相似（不同的只是，哈爾滿堿為去甲哈爾滿堿的c-甲基衍生物），用紅外光譜可以容易地鑒別它們。

    在植物中遇到新的化合物時，紅外光譜測定亦有助于結構闡明。雖然在化學結構和紅外光譜吸收峰之間有許多已知的聯系，然而一個復雜光譜的實際可能是困難的，操作需要許多經驗。不過，就某些種類的化合物來說，解釋可能是比較簡單的事。測量醌類的1800-1650㎝-1之間的羰基頻率可以立即明白羰基是否與鄰接的羥基螯合。例如，以蒽醌為例，無螯合的醌在1678-1653㎝-1之間有一條譜帶；具有一個α-羥基的醌在1675-1647㎝-1和1637-1621㎝-1之間顯示兩條譜帶；具有兩個α-羥基的醌在1675-1661㎝-1和1645-1608㎝-1之間有吸收帶。 

紅外光譜數據的來源可以查閱各種目錄，例如Hershenson（1959，1964）。有關紅外光譜測定的好的引論性評價見Eglinton（1970）。Cross和Jones（1969）的著作是一本通俗、實用的引論性教科書，已出第三版。 

1.4.4 質譜法（MS） 

稍晚（大約1960年）引入的質譜法革新了天然產物的生物化學研究，并在許多方面減輕了植物化學家的工作。這種技術的價值是：它只需毫克量級的物質，能提供精確的分子量，能產生一個特殊化合物的復雜的特征碎片圖譜，利用這種圖譜可以鑒定該化合物。 

質譜測定大體上由兩步組成：降解痕量的有機化合物和按質量大小記錄其碎裂圖譜。樣品蒸發擴散入質譜儀的低壓系統，在這里以足夠的能量使樣品電離，引起化學鍵斷裂，由此產生的帶正電荷的離子在磁場中被加速，磁場把離子分散開并測定特定質荷比的離子的相對風度，由此記錄的離子豐度對質量的關系圖構成質譜圖，它是由一系列不同質量單元的強度不同的線條組成（見圖1.6）。 

在許多情況下，某些母體化合物在氣化過程中保存，它將被記錄為分子離子峰。然后可以對這個（以及任何別的）特殊離子進行很精確的質量測量（精確到0.0001質量單位）。這種精確度足以指出物質的精確分子式，因此不必再進行常規的元素分析（通常需幾毫克的物質）。

不象紫外和紅外分光光度計那樣可以由植物化學家自己操作，質譜和核磁共振儀器比較昂貴，而且復雜得多，所以一般要由培訓過的人員操作。因此植物化學家去供分析的樣品然后取回如圖1.6所示的圖譜。這種技術幾乎成功地應用于每一類低分子量的植物成分，甚至已用于肽的分析。那些在質譜儀中蒸發的而揮發性太低的化合物，可以轉化為三甲基硅醚、甲酯或類似的衍生物。赤霉素類化合物正是這種方法測定的。質譜法常常與氣液層析（色譜）法聯用，色譜-質譜聯用可同時提供許多結構上復雜的化合物的定性和定律鑒定，這些化合物可能一起存在于某一植物提取液中。 

 

下面一個例子足以說明質譜測量在植物化學研究中的價值。第一個從高等植物中分離出來的天然存在的生長調節劑細胞分裂素-玉米素就是用質譜測定的。Shannon和Letham（1966）測定它的結構為6-（4-羥甲基-反式2-丁烯氨基）嘌呤。質譜測定的結果（圖1.6）對其鑒定相當有幫助，因為在219處有一個顯著的分子離子峰，確認其分子式為C10H13ON5。碎片m/z202(M-OH)和m/z188(M-CH2OH)揭示伯醇的存在。碎片m/z148指明烷基定位在N-上。最后，從特征的碎片m/z136，135和108（大多數腺嘌呤衍生物所顯示的特征碎片）確證腺嘌呤核的結構。 

   在質譜測定方面，新技術層出不窮?，F代化的光譜儀可以配上快原子轟擊源（FAB），因而能分析脆弱的或非揮發性的有機化合物，包括鹽類和高分子量物質。以前，用質譜法分析植物糖苷，O-糖苷的糖在測定過程中失去而未被檢測，但現在用FAB-MS測定，能夠得到原始糖苷的分子離子。 

新近出版的兩篇論文（Waller，1972和Dermer，1980）中有一些質譜數據應用于植物生物化學研究的例子。讀者也可以參考本節中已提到過的普通光譜學中有關質譜法的敘述。 

1.4.5 核磁共振譜 

質子核磁共振譜測定本質上是通過測量有機化合物的氫原子的磁矩以測定其結構的一種方法。在大多數化合物中，氫原子連接到不同的集團上（如-CH2-、-CH3、-CHO、-NH2、-CHOH-等等），質子核磁共振譜記錄這些不同環境的氫原子數。但是它不能提供有關分子的碳骨架特征的任何直接信息。這種信息只能通過13C核磁共振譜獲得，這一點在后面敘述。 

實際上，將物質的樣品溶液（溶于惰性溶劑中）置于強磁極之間，其質子按它們在分子內的分子環境發生不同的化學位移。在核磁共振譜儀中以相對于一個標準，通常為四甲基硅（TMS），測量這些質子的化學位移；四甲基硅（烷）是一種惰性化合物，可以加到樣品溶液中而不會發生可能的化學反應。 

化學位移以δ或τ單位測量。這里τ=10δ，δ=△ν×106/輻射頻率。△ν為樣品與參比化合物四甲基硅的吸收頻率之差，單位為赫茲（Hz）。因為總輻射頻率通常為60兆赫茲（60百萬赫茲），而位移以赫茲為單位測量，所以位移單位常常稱為p.p.m.。另外，信號的強度可以積分，其強度表示在任一頻率下共振的質子數。 

用于核磁共振譜測量的溶劑必須是惰性的和不含質子的。因此使用得溶劑局限于四氯化碳（CCl4）、氘氯仿（CDCl3）、重水（D2O）、氘丙酮（CD3COCD3）或氘二甲基亞砜（(CD3)2-S=O）。極性化合物常常微溶于或不溶于所用的溶劑中，必須把它們轉化為三甲基硅醚進行測量（見圖1.7）。至少需要5-10mg樣品，這就限制了核磁共振譜在許多植物化學實驗中的應用。但是只需mg量分析樣品的儀器正在起用。核磁共振譜測定超過質譜法的一個優點是：在測定之后樣品不發生變化，至少可以回收并用于其它測定。 

正如其他波譜測量一樣，質子核磁共振譜測定可以作為植物化學家的指紋技術。但是，必須記住，波譜的復雜性與存在的不同類型的質子數直接相關。因此，一個高度取代的復雜生物堿給出的信號，可能比一個簡單的脂肪烴少。核磁共振譜的主要用途是與其它波譜技術結合進行結構測定。它在測定化合物的類別方面是十分重要的。表1.4中列出一些典型的天然產物類的化學位移例子。芳香族的質子（在苯衍生物或雜環化合物中）明顯地不同于脂肪族化合物的質子，而且在一類化合物內，核磁共振光譜測量常常還能作為鑒定個別結構的方法。 

質子核磁共振譜可能是十分復雜的，例如由于連接到相鄰碳原子上的質子之間的相互作用，波譜的信號可能呈現“雙峰”或“三峰”，而不是單峰。因此譜圖的解釋要求許多技巧。盡管如此，無需非常詳細分析波譜就可以獲得有用的植物化學信息。這里舉兩個例子。第一，在測定蘋婆酸（Sterculic acid）的結構時，化學家們起初不能接受這個獨特的脂肪酸在其結構中有一個明顯緊張的環丙烯環，而選擇另一個分子式-雙鍵位于鄰接環丙烷環的位置上。但是核磁共振譜清楚地表明，該化合物必定有一個環丙烯環，因為在烯烴區（5.2-5.7δ）沒有質子信號，因此另一個分子式是不可能的。