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01 何為真菌？ 圖片源于同行微信分享，版權歸原作者所有 基本特征 ①真核細胞型微生物，屬于真菌界； ②具有典型細胞核，有完整的細胞器，不含葉綠素，不分根、莖、葉； ③單核細胞或多核細胞組成的； ④細胞壁含幾丁質和β-葡聚糖； ④以寄生或腐生的方式生存，能進行有性生殖或（和）無性生殖 ⑤致病性：引起人類感染性、中毒性、變態反應性疾病。 真 菌 的 分 類 （1）分類單位： （2）按形態分： ①單細胞真菌 ： 酵母菌：如新生隱球菌，以出芽方式繁殖，不形成真假菌絲； 酵母樣菌：如念珠菌屬，以出芽形成芽管，形成假菌絲。 ②多細胞真菌 ： 由菌絲+孢子組成絲狀菌（霉菌） 形成菌落為絲狀型，如：曲霉、毛霉、青霉、皮膚癬菌等、各種霉菌的菌絲和孢子形態不同，是鑒別真菌的重要標志。 「菌絲」:呈管狀，長度隨不同的生長條件而異，是由成熟孢子以出芽方式繁殖時形成的。在適宜的環境中由孢子長出芽管，并長出分支而不斷生長形成的或有一段菌絲細胞增長而形成，許多菌絲交織成團，成為菌絲體。 A.按形態不同： 螺旋狀、球拍狀、結節狀、鹿角狀、梳妝、關節狀菌絲等。  B.按結構不同：  有隔菌絲：是由橫隔將管狀結構的菌絲分隔成一連串多細胞樣的絲狀體如霉菌、青霉和毛癬菌菌絲（大多致病菌為有隔菌絲）。 無隔菌絲：無隔膜整條菌絲為單個細胞，細胞質內有多個細胞核，根霉和毛霉的菌絲 。 C.根據菌絲生長方式（功能）不同分:  營養菌絲：伸入到培養基內的菌絲。 氣生菌絲：露出培養基表面、向空間生長。 生殖菌絲：氣中菌絲可生產有性或無性孢子。 菌絲的結構和組成是真菌形態的的一個重要的特征，這有助于對真菌的鑒別。 「孢子」：是真菌的繁殖體，不同的真菌都有其特定的孢子，其形態、大小表面紋飾和色澤等各不相同。 根據繁殖的方式分為兩種： A.有性孢子：是經過兩性細胞接合的繁殖方式，通常經過質配、核配和減數分裂三個過程。如：孢子菌絲、皮炎芽生菌、石膏樣小孢子菌等。 B.無性孢子（多為病原性真菌繁殖方式） 無性孢子按形態不同分： ①分生孢子：真菌中最常見的一種。 大分生孢子：（多細胞性）其大小、細胞數和顏色是鑒定真菌的重要依據。
體積較大，分隔成較多細胞，長呈梭形，棍棒型，梨形 小分生孢子：（單細胞性）各種真菌都能產生小分生孢子，鑒別意義不大。
體積小，單細胞性外壁薄，有球型，卵形，梨形以棍棒狀等各種不同的形態及。 ②葉狀孢子：菌絲內細胞直接形成。 芽生孢子：由細胞出芽生成，多數芽生孢子生長到一定大小即與母體脫離，若不脫離，形成菌絲狀，被稱為假菌絲。 關節孢子：菌絲生長到一定階段后，出現很多橫膈膜，然后從橫隔膜處斷裂形成矩形、筒形或短柱狀的孢子。多出現與陳舊的培養物中。 厚膜孢子：菌絲或分支的頂端有少數細胞有菌絲內胞質濃縮、薄壁增厚形成，是為了抵抗不良環境，真菌的一種休眠體。環境適宜時又可出芽繁殖。 ③孢子囊孢子：菌絲分支的頂端或孢囊梗膨大形成孢子囊，內含許多孢子，孢子成熟后則破囊而出。如毛霉、根霉等形成的孢子囊孢子。
02 真菌檢驗的基本技術 1.標本直接鏡檢 · 生理鹽水 · 透明膠帶法 2.染色鏡檢法 · 革蘭染色（為革蘭陽性，為深紫紅色） · 墨汁染色法 · 乳酸酚棉藍染色法 · 熒光染色 · 糖原染色（PAS）：真菌及組織內的多糖多糖-紅色 ；核-藍色 ;背景-淡綠色。 · 銀染色法 · 吉姆薩染色、瑞氏—吉姆薩染色法 · 病理組織染色法 3.真菌培養及鑒定 （1）培養方法 · 點植法 · 劃線法 · 直接培養與間接培養 · 試管培養 · 平板培養 · 大培養 · 小培養：玻片法、方塊法、小鋼圈法 （2）培養條件 · pH一般在5.0-7.0（大部分真菌適應中性或偏酸環境）； · 溫度：多25-28℃，深部真菌一般37℃；二相真菌26℃左右，為菌絲相，37℃，酵母相。 · 滲透壓 （3）常用真菌培養基  4.培養真菌的菌落形態： ①酵母型菌落：（類似一般細菌菌落） 菌落光滑、濕潤、柔軟、致密，似酵母。為單細胞真菌的菌落，以出芽方式繁殖，如新型隱球菌顯微鏡檢可見圓形或橢圓形生芽細胞。 ②類酵母型：外觀性狀同酵母型菌落，但除有生芽細胞外， 還有假菌絲伸入培養基中，是由伸長的芽生孢子形成如白念珠菌。 ③絲狀菌落：菌絲疏松，呈棉絮狀、絨毛狀或粉末狀等，一部分菌落向上生長并形成孢子，一部分深入培養基下層。菌絲正面和背面可顯示各種不同的顏色，常作為鑒定菌種的參考。 6.臨床標本的真菌學檢查 （1）根據標本類型分為： ①血液標本 ②骨髓標本 ③中心靜脈導管標本 ④腦脊液標本 ⑤痰、肺泡灌洗液、保護毛刷標本 ⑥分泌物標本 ⑦尿液標本 ⑧糞便標本 （2）根據侵襲部位分 ： 皮膚黏膜感染性真菌 ： ①皮膚癬真菌 毛癬菌屬 表皮菌屬：只有絮狀表皮癬菌致病 小孢子菌屬 ②表面感染真菌 ③皮下組織感染真菌：引起頭癬、足癬、股癬、甲癬、體癬 引起侵襲性感染性真菌： ①酵母型真菌：念珠菌屬、隱球菌屬 ②絲狀真菌：曲霉、毛霉、鐮刀菌屬 ③卡氏肺孢菌 ④二相性真菌：組織胞漿菌、馬爾尼菲青霉、粗球孢子菌、副球孢子菌 「二相性真菌」: 二相性：有些真菌可因營養、溫度、顏色等環境的改變，二兩種形態發生互變。 二相性真菌：在體內或體外含動物蛋白的培養基上37℃培養為酵母型真菌；在體外普通培養基上25℃培養為霉菌型真菌，如球孢子菌、組織胞漿菌、芽生菌和孢子絲菌、副球孢子菌。 03 實驗室常見真菌 念珠菌屬 1.分類 念珠菌屬 (Candida) （假絲酵母菌屬） 生物學上屬于半知菌亞門， 該屬菌有150多個種，常見致病的有11種。 白念珠菌(Candida albicans)（白假絲酵母菌）為最常見的致病菌。 白念珠菌（C. albicans） 熱帶念珠菌（C. tropicalis） 克柔念珠菌（C. krusei） 光滑念珠菌（C. glabrata） 季也蒙念珠菌（C. guilliermondi） 維斯念珠菌（C. viswanathii） 近平滑念珠菌（C. parapsilosis） 都柏林念珠菌（C. dublinniensis） 星形念珠菌（C. stellatoidea） 克菲念珠菌（C. kefyr） 2.臨床意義
白念 女性的念珠性陰道炎、外陰炎；男性念珠菌龜頭炎、包皮炎 體質虛弱的嬰兒：鵝口瘡念珠性陰道炎、外陰炎、肺炎、膀胱 炎、腎盂腎炎和心內膜炎 中樞神經系統白念珠菌病：腦膜炎、腦膜腦炎、腦膿腫等 熱帶 先天性免疫缺陷的致病菌，可引起皮膚、黏膜和內臟念珠菌病 克柔 引起系統性念珠菌病，特別是先天性免疫缺陷患者和大量接受抗菌藥物治療的患者 光滑 人體一種腐生菌，可導致泌尿生殖道感染，也是新生兒的條件致病菌 3.生物學性狀 ①菌體圓形或卵圓形，革蘭陽性，著色不均勻。 ②以出芽繁殖,形成米色或灰色的酵母樣菌落，有時表面有褶皺。 ③組織內：可見芽生孢子和假菌絲。 玉米粉培養基：假菌絲、厚膜孢子 墨汁染色：陰性---沒有莢膜 4.微生物檢查學 ①直接鏡檢：一般用于淺部念珠菌的檢查，也可用于血、尿、腦脊液、活檢組織等標本的檢查。顯微鏡下觀察，呈圓形或卵圓形的芽生孢子，假菌絲和菌絲。 克柔可見假菌絲成對分枝，有細長的芽生孢子； 光滑可見卵圓形芽生孢子，細胞尖端單芽，無真假菌絲不產生厚膜孢子 ②分離培養及鑒定：可接種于沙保弱、血平板等培養基。沙保弱培養基，25℃或37℃培養1-4天 白念珠菌：乳白色、奶油色、隆起、表面濕潤、光滑類酵母型菌落，鏡檢可見假菌絲和芽生孢子； 熱帶念珠菌：乳白色至奶油色、隆起、無光澤、或稍有光澤的菌落； 克柔念珠菌：生長快，菌落大，呈柔軟、乳白色至乳黃色菌落。 光滑念珠菌：42℃可生長，25或37℃培養3日，形成光滑、濕潤、隆起、白色和奶油色乳酪樣較小菌落。 5.念珠菌的鑒定方法 ①芽管形成試驗：待測菌加0.5～1ml人或動物血清 ——鏡檢（37 ℃ 水浴1.5-4h) 結果：絕大部分白假絲酵母菌可形成典型的放大鏡柄狀芽管 并非所有的白念珠菌都形成芽管，需要設陰（熱帶念珠菌）陽（白念珠菌）性對照。培養時間不可過長，熱帶念珠菌在血清中培養6h或更久也可形成芽管。 ②厚膜孢子形成試驗：在玉米粉瓊脂上，25℃-28 ℃孵育24-48h，念珠菌屬中僅白念珠菌產生厚壁孢子。 ③氯化三苯基四氮唑反應 白念-不變色（淡紅） 熱帶-深紅色或紫色 其它-紅色 ④商品化顯色培養基 原理：是一類利用微生物自身代謝產生的酶與相應顯色底物反應顯色的原理。（顯色底物：由產色基因和微生物部分可代謝物質組成，在特異酶作用下，游離出的顯色基因顯示一定顏色，觀察顏色） 翠綠色菌落為白念珠菌， 鐵藍色菌落為熱帶念珠菌， 淡粉紅色菌落為克柔念珠菌， 紫色菌落為光滑念珠菌 其它為白色 ⑤G試驗 G試驗 （1,3-β-D-葡聚糖）可特異性激活鱟變形細胞裂解物種的G因子，引起裂解物凝固） G試驗檢測的是真菌的細胞壁成分——1,3-β-D-葡聚糖，人體的吞噬細胞吞噬真菌后，能持續釋放該物質，使血液中含量增高。 原理： 1,3-β-D-葡聚糖能特異性激活反應主試劑中的G因子、凝血酶原等，引起顯色基質中酰胺鍵的斷裂，產生能在405nm下的顯色物質pNA，，引起吸光度的變化。進行定量檢查。 臨床意義： 適用于除隱球菌和接合菌（毛霉菌）外的所有深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。以下情況可出現假陽性： （1）使用纖維素膜進行血透，標本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料； （2）靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； （3）鏈球菌血癥； （4）操作者處理標本時存在污染。 ⑥其他：抗原檢測、抗體檢測、核酸檢測 隱球菌屬 1.致病特點：一般為外源性感染，經呼吸道侵入人體，可由肺經血傳播至腦及腦膜，也可侵犯皮膚、骨和關節。 ?最易侵犯的是中樞神經系統，引起慢性腦膜炎，出現腦膜刺激癥狀。 ?新生隱球菌病好發生于體質虛弱，免疫力低下者。如白血病、艾滋病、惡性腫瘤、糖尿病等病人。 ?莢膜多糖是新生隱球菌重要的致病物質 2.生物學性狀 ?圓形的酵母型菌，外周有莢膜，折光性強。 ?一般染色法不著色，難以發現。 ?非致病的隱球菌在37 ℃不生長，無莢膜 ▲ 徐和平/攝 3.微生物檢驗 （1）直接檢查 ①墨汁負染色： 通常用于檢查腦脊液等涂片中的隱球菌，是涂片中檢查隱球菌的首選方法 標本中菌體較大，呈較大的球型，菌體周圍有肥厚的莢膜 ②隱球菌莢抗原的檢測：常見有乳膠凝集法、膠體免疫金層析法、酶聯免疫吸附法等。 ▲ 徐和平/攝 ③PCR檢測 （2）分離培養 菌體常見出芽現象、在沙保弱和血平板上25 ℃和37 ℃均可生長。但30℃生長良好，菌落奶白色至棕黃色，粘稠、不透明、邊緣完整。 （3）鑒定： ①尿素酶試驗： 新型隱球菌（+）、白假絲酵母菌（-） ②糖同化及發酵試驗： 新型隱球菌、淺白隱球菌等可同化纖維二糖、肌醇等，但均不能發酵糖類。 ③酚氧化酶試驗： 接種左旋多巴-枸櫞酸鐵和咖啡酸培養基，經2-5天，新型隱球菌呈棕黑色菌落。 曲霉菌 1.基本特征 ?多數只發現了無性階段， ?條件致病菌，最常見的是煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉 ?可侵犯機體許多部位，尤其是呼吸系統和全身性曲霉病。 ?呼吸系統曲霉菌病引起支氣管哮喘或肺部感染。 ?全身性曲霉菌病原發病灶主要是肺，可隨血播散至腦、心肌和腎等。 ?有些曲霉菌能產生毒素引起機體食物中毒，黃曲霉毒素，雜色霉毒素有致癌作用。 2.生物學特征： ▲ 徐春暉/繪 組成：分生孢子頭和足細胞 分生孢子頭：分生梗莖、頂囊、瓶梗 梗基、分生孢子鏈 殼細胞：厚壁，頂生或間生的囊狀細胞
▲ 徐和平/供 閉囊殼：有性生殖器官，壁薄，由一層或數層多角細胞構成
▲ 徐和平/攝 3.分離培養 · 曲霉菌在沙保培養基上，室溫及37℃～45℃均能生長 · 形成絨毛狀或絮狀菌落 · 菌落開始為白色，隨著孢子的產生，不同菌種可呈現各種不同的顏色 · 多數菌種只有無性階段，少數菌種存在有性階段 煙曲霉 ?菌落擴延，藍綠色至煙綠色，背面無色或黃褐色，絨毛狀，37~45攝氏度生長良好。 ?頂囊燒瓶狀：單層瓶梗，布滿頂囊表面2/3；分生孢子頭圓柱形；分生孢子梗無色或綠色、光滑，無閉囊殼。 ?引起肺曲霉病 黃曲霉菌 ▲ 徐和平/供 ?菌落表面黃綠色，背面無色或微褐色，羊毛狀 ?頂囊近球形；單層和/或雙層小梗，布滿頂囊表面；分生孢子頭放射狀或圓柱狀。孢子梗黃綠色、粗糙 ?引起肺、外耳道曲霉病，甲癬 黑曲霉菌 ?生長迅速，菌落初為白色羊毛狀，后為黑色或黑褐色粗絨狀，背面無色或略帶黑褐色 ?頂囊近球形；單層和/或雙層瓶梗；分生孢子頭球形放射狀，褐色至黑色；孢子梗無色至褐色、光滑 ?引起外耳道、肺和膿皮癥樣曲霉 其他霉菌 土曲霉菌落 雜色曲霉菌落 構巢曲霉菌落 4.微生物檢驗 （1）顯微鏡檢查 ①透明膠帶法 可有效的保持菌落的生長形態，便于觀察真菌的產孢子結構及著生方式和孢子的排列方式。制片的過程應在生物安全柜中進行，疑為二相真菌，除孢子絲菌外不可采用此法。 在顯微鏡下的特征性表現： 可見較多的分生孢子頭，頂端膨大形成頂囊，頂囊上有小梗，小梗上有許多小分生孢子，透明二叉分支形（分枝呈45°角） 有隔菌絲 黃曲霉菌 煙曲霉菌 黑曲霉菌 ②乳酸酚棉藍染色法 （2）抗原、抗體的檢測： 包括抗原、抗體及代謝產物檢測 ?抗原檢測：抑制性ELISA患者血清中的曲霉菌抗原，如GM試驗 ?抗體檢測：檢測患者血清中抗曲霉抗體，常用免疫擴散，對流免疫、ELISA、放射、間接熒光等 ?代謝產物：G試驗檢測細胞壁成分1-3-β-D甘露聚糖 G試驗檢+GM試驗可提高曲霉的檢出率 GM試驗 （Galactomannan） ----目前國際公認的曲霉菌的診斷方法 GM試驗檢測的是半乳甘露聚糖，主要適于侵襲性曲霉菌感染的早期診斷。曲霉菌特有的細胞壁多糖成分是β（1-5）呋喃半乳糖殘基，菌絲生長時，半乳甘露聚糖從薄弱的菌絲頂端釋放，是最早釋放的抗原。GM釋放量與菌量成正比，可以反映感染程度。連續檢測GM可作為治療療效的監測。在造血干細胞移植患者中的診斷敏感性高。 一步法酶免夾心微孔板方法檢測人血清中的半乳甘露聚糖 ,采用鼠EBA-2單克隆抗體，直接和曲霉菌半乳甘露聚糖結合。 將鼠EBA-2單克隆抗體微孔板并結合抗原，且檢測結合到已激活微孔板（結合物試劑：過氧化物酶連接的單克隆抗體）上的抗原。 將已經過加熱處理（以便去除免疫復合物和沉淀可能干擾實驗的血清蛋白質）的EDTA血清樣本加入孔中。 孵育——洗板——加底物（顯藍色）——加入酸溶液終止反應（藍色變黃色）——比色（450nm和620/630nm波長的分光光度計（酶標儀）測定樣本和對照的吸光度（光密度）） ?以下情況可出現假陽性： （1）使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他唑巴坦； （2）新生兒和兒童； （3）血液透析； （4）自身免疫性肝炎等； （5）食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等。 ?以下情況可出現假陰性： （1）釋放入血循環中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持續存在而是會很快清除； （2）以前使用了抗真菌藥物； （3）病情不嚴重； （4）非粒細胞缺乏的患 03 案例分析 患者胡某，男，21歲，因“騎車摔傷致胸腹部、腰部疼痛4小時”入院。 該病人基本特征如下： 1.患者為男性青年，既往體健。否認“肝炎”、“結核”病史，否認“糖尿病”、“冠心病”病史，否認食物、藥物過敏史，否認重大手術，外傷史。 2.患者約于4小時，騎車摔傷致胸腹部、腰部疼痛，致全身多處流血，伴胸悶，當時神志清楚。送我院急查。 各種炎癥指標均增高，臨床醫生一直在使用抗感染的藥物防止細菌感染。 11月初因患者病情加重，給予氣管切開接呼吸機支持呼吸 后，與患者血液中檢測到白念珠菌，且G試驗、GM試驗均明顯增高。 臨床醫生給予卡波芬凈等抗菌藥物給予治療，后期檢查。血中未查到白念珠菌。 04 提提神， 動動腦 1. 鑒定曲霉常用的培養基是: A、察氏瓊脂 B、尿素瓊脂 C、腦心葡萄糖血瓊脂 D、酵母浸膏磷酸鹽瓊脂 E、沙氏培養基 2.真菌性腦膜炎最常見的病原菌: A、白假絲酵母菌 B、曲霉菌 C、毛霉菌 D、新型隱球菌 E、球孢子菌 3.屬于假絲酵母菌的特點： A、革蘭染色陽性 ，著色均勻 B、有菌絲和孢子 C、無假菌絲 D、沙氏培養基生長良好 E、菌落呈絨毛狀 4.上呼吸道感染應采集： A、鼻咽拭子標本 B、咽拭子標本 C、痰標本 D、支氣管鏡標本 E、胃內標本 上期答案：1.E 2.C 3.CE 4.BCE 5.ABCDE(你答對了嗎) 05 教師補充 1、曲霉和毛霉的鑒別要點:①曲霉有隔，毛霉無隔②曲霉呈透明二叉分支（分枝呈45度角），毛霉無分枝 2、質譜儀:將待檢菌薄薄涂于靶板上（96孔）加甲酸破壞細胞壁釋放出蛋白質等物質待干后加基質與釋放出來的蛋白質結合形成結晶，根據結晶大小進行打條帶，與質譜庫菌進行對比。 3、在實驗室中一定要注意生物安全，學會保護自己，操作中注意無菌操作 4、G實驗鑒別深部真菌（主要是念珠菌）、GM實驗鑒別曲霉，都是輔助診斷的的指標，影響因素比較多。 指導老師： 張麗 副主任技師，資深檢驗人。從事醫學檢驗工作及教學二十余年，發表論文多篇。臨床經驗豐富，帶教風格嚴謹認真，親切和藹。 |
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