常用的單克隆抗體檢測方法

通過雜交瘤技術制備單克隆抗體，在雜交瘤制備完成后，需要對抗體進行一個檢測，本文介紹了幾種常用的抗體檢測的方法

（1）免疫酶技術

免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由于它特異性強，靈敏度高，現已廣泛用于篩選和鑒定單抗。

①器材和試劑

a、包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調PH至9.6。Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。

b、洗滌緩沖液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。

c、稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。

d、酶反應終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。

e、底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩定，易形成沉淀，因此一次不宜配制過多。

f、底物使用液：OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。

g、抗體對照：以骨髓瘤細胞培養上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。

h、抗原： 可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細胞或全菌抗原。淋巴細胞等懸液。

i、酶標抗鼠抗體或酶標SPA或其他類似試劑。

j、 細胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。

k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。

l、酶聯免疫閱讀儀；或光鏡。m、吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。

②可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

a、純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。

b、以50-100ul/孔量加入酶標板孔中，置4℃過夜或37℃吸附2小時。

c、棄去孔內的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。

d、每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時；該步驟對于一些抗原，可省略。

e、洗滌液洗3次；此時包被板可-20℃或4℃保存備用。

f、每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養上清，同時設立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育1-2小時；洗滌，拍干。

g、加酶標第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時，洗滌，拍干。

h、加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鐘。

i、以2mol/L H2SO4終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值。

j、結果判定：以P/N2.1，或PN+3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結果。

③全菌抗原的ELISAS

a、新鮮培養的細菌用蒸餾水或PBS懸浮，并調整細菌濃度至1×108個/ml。必須指出，對于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。

b、每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細菌懸液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。

c、步驟b也可采用先每孔加50ul細菌懸液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃預冷的無水甲醇室溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃ 2小時封閉。d、洗滌液洗3次；此時包被板可在-20℃或4℃保存備用。

e、以下步驟同上法。

④用全細胞抗原的ELISA

a、按常規方法培養細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染細胞，進行細胞計數，用PBS制成適當濃度懸液。

b、淋巴細胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細胞分離液之上，1500rpm離心30分鐘，吸取界面細胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細胞懸液。該細胞懸液中若仍混有紅細胞，離心后加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細胞懸液稀釋至適當濃度。

c、每孔加100ul上述a或b的細胞懸液，使每孔含細胞5×104個；1500r/min 15分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鐘；可4℃或-20℃保存備用。

d、以下步驟同上法。

⑤抗體捕捉ELISA試驗

本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：

a、以適當濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標板，每孔加100ul，37℃ 2小時或4℃過夜。

b、洗滌、拍干后加待測的McAb樣品，37℃ 1-2小時。

c、洗滌后加適量的抗原，37℃ 1-2小時。

d、洗滌后加入酶標多克隆抗體，37℃ 1-2小時。洗滌后加底物顯色，判定結果。

⑥ABC-ELISA試驗

ABC-ELISA是在常規ELISA原理的基礎上，增加了生物素（Biotin）與親和素（Avidin）間的放大作用。親和素有4個亞單位組成，對生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質共價結合。因此，結合了酶的親和素與結合有抗體的生物素發生反應即起到了多極放大作用。其操作步驟如下：

a、已知抗原的包被及加待檢McAb樣品，同間接ELISA試驗。

b、加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔100ul，37℃ 1小時；洗滌。

c、加酶標親和素，每孔100ul，37℃ 30分鐘洗滌；加底物顯色，判定結果。

⑦Dot-ELISA試驗

免疫斑點試驗（Dot-ELISA）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體，進行抗原抗體反應的免疫檢測手段。該法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其與相應標記物（HRP、AP、膠體金）作用形成不溶性產物，呈現斑點狀著色，從而易于判定結果。根據所用的標記物不同，可分為HRP 免疫斑點試驗、AP免疫斑點試驗和免疫金銀斑點法等。其操作步驟大致如下：

a、將抗原液2-5ul點加于纖維素膜上，室溫37℃干燥。

b、將纖維膜浸入封閉液中，37℃ 30分鐘。

c、用洗滌液洗2次，吸干后加待檢McAb樣品，37℃ 1小時；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HRP或AP或膠體金標記的抗鼠Ig抗體，37℃作用30分鐘。

d、同法洗滌，吸干，用新配的相應底物溶液顯色，然后水洗終止反應，觀察結果。

⑧免疫組化染色法

該法主要用于檢測針對細胞抗原成分的McAb，常用的方法是間接免疫過氧化物酶試驗（IIP，indirect immunoperoxidase）及APAAP技術。其結果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。

（2）免疫熒光技術

免疫熒光技術可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測，如細胞性抗原（包括細菌和動物細胞）、感染細胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優點，在McAb的篩選與鑒定上具有重要的應用價值。

①器材和試劑

a、供檢測抗體用的抗原制備固定細胞片或板，活細胞懸液。

b、PBS（PH7.2，0.01mol/L）

c、待檢的McAb樣品。

d、冷丙酮

e、FITC（異硫氰酸熒光素）或TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標記的抗鼠Ig抗體等

f、熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機，水浴箱等。

②間接免疫熒光法

a、固定細胞片的制備：生長在蓋片上的細胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4℃丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20℃保存備用；單細胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細胞涂片的制備：將10ul細菌懸液（1×108個/ml）涂抹7×21mm蓋片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分鐘，于-20℃保存備用。

b、蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加10-20ul雜交瘤上清或其他待檢樣品；設立陽性、陰性對照；置37℃水浴孵育0.5-1小時。

c、取出蓋片置PBS中用磁力攪拌器洗滌15分鐘。

d、蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig的熒光抗體10-20ul，37℃孵育0.5-1小時。

e、同法洗滌15分鐘；取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS）封于干凈載玻片上。

f、光顯微鏡上觀察，陽性結果可見特異性熒光（FITC為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。

g、細胞固定片的制備，也可改在培養板孔中進行，其余步驟同上，在觀察結果時，將培養板翻轉置于熒光顯微鏡下，判斷標準不變。

③細胞的膜熒光染色完整的活細胞的細胞膜，抗體不能透過。如果細胞在4℃操作，則熒光染色僅限于細胞膜。必須注意死細胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗過程中要保證細胞的高活力。活細胞的膜熒光染色大致步驟如下：

a、制備活性較好的細胞懸液，調節濃度至107個/ml。

b、在小試管（5×50mm）中加入100ul細胞懸液，再加入100ul待檢McAb的樣品，混勻，4℃作用30-90分鐘。

c、用洗滌液（PBS 900ml，小牛血清50ml，4%NaN3 50ml）洗二次，每次加洗滌液1-5ml，1000r/min離心5分鐘，棄上清。加入100ul熒光抗體，4℃作用30-90分鐘。

d、同法洗滌，將細胞重新懸于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。

e、立即在熒光顯微鏡上檢查。

f、細胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4℃可保存一周。

（3）間接血凝試驗

間接血凝試驗又稱被動血凝試驗（PHA），是目前應用較廣的檢測方法之一。本試驗是以包被可溶性抗原的紅細胞作為指示系統，當被檢抗體與包被在紅細胞上的抗原產生特異性反應時，導致紅細胞呈凝集現象?？梢?，該法具有靈敏、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優點，而且經改用醛化紅細胞以后，克服原來重復性差的缺點。

①器材和試劑

a、綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。

b、緩沖液：PBS（PH7.2）；醋酸緩沖液。

c、甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝劑等。

d、血凝板，振蕩器等。

②多糖抗原的間接血凝試驗

a、甲醛化綿羊紅細胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細胞壓積的PH7.2 PBS（Na2HPO4·12H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，NaCl 8.01g，蒸餾水1000ml）充分洗滌5次，每次1500r/min 5-10分鐘，直至上清測定無蛋白質（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無白色沉淀），再以相同緩沖液配成25%紅細胞懸液；將25%紅細胞懸液與20%甲醛以2.5：1的比例混勻，37℃水浴作用2小時，每15分鐘振蕩一次，紅細胞顏色逐漸由鮮紅色轉變為棕色；以PH7.2 PBS洗滌4次，每次2000r/min 10分鐘，再以同樣的PBS制成25%紅細胞懸液；其后，重復醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細胞懸液，加甲醛至0.3%防腐，4℃保存備用。

b、脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細胞的制備：取脂多糖（LPS），以0.2mol/L PH8.0 PB液，調整多糖濃度至120ug/ml，然后100℃水浴處理1小時；將冷卻至37℃的熱處理LPS與6%醛化紅細胞等量混合，37℃攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min 10分鐘，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗滌4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4℃備用，或凍干保存。c、McAb的篩選：取待測McAb樣品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同時設立陰性、陽性對照；再加入0.5-4%致敏紅血球懸液25ul，在振蕩器上混勻30秒；置室溫或37℃ 30-60分鐘觀察結果。陰性對照孔應呈緊縮的圓點。

③可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗

a、紅細胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于紅細胞壓積的PBS洗滌4-6次，然后配成8%紅細胞懸液；向此8%紅細胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室溫緩慢攪拌17小時；其后洗滌3次，配成20%雙醛化紅細胞懸液，加0.1% NaN3防腐，4℃保存備用。

b、致敏紅細胞：取20%雙醛化紅細胞0.1ml，1500r/min 10分鐘，棄上清，沉積紅細胞加0.2mol/L PH4.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液1ml，并加最適濃度（應預先測定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原1ml，混勻，于45℃致敏30分鐘，有時輕輕搖動，使紅細胞不下沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細胞壓積的PBS洗3-4次，最后用PBS配成0.5-1%致敏紅細胞，4℃保存備用。

c、McAb測定：同上法。

（4）放射免疫測定

放射免疫測定是用放射性同位素標記抗原或抗體，以檢測相應抗原或抗體的定量方法。在篩選和鑒定單抗時常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測樣品中的McAb，其操作步驟如下：

a、用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔內，100ul/孔，4℃過夜或37℃ 2小時。

b、棄去抗原液，每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS，4℃ 1-2小時封閉。

c、用BSA-PBS洗滌3次，每次3分鐘。

d、加待檢樣品，每孔100ul，設立陰性孔、陽性孔和空白孔；37℃1-2小時，同法洗滌。e、每孔加125I標記的抗鼠Ig抗體工作液100ul，37℃ 1-2小時，同法洗滌。

f、用γ-射線閃爍計數儀分別測定各孔放射性。通常要求樣品孔和陽性對照孔的放射性脈沖分別超過本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性為基準，凡樣品孔與陰性孔放射性之比大于3的樣品定為陽性。