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螢光素酶是理想的報告基因，因為哺乳動物細胞中不含內源性螢光素酶，一旦轉錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時在所有的化學發(fā)光反應中，它的光產物具有最高的量子效率，檢測靈敏度高。熒光素酶報告基因被廣泛用于miRNA靶基因驗證。 熒光素酶報告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構建至pGL3-basic載體中報告基因Luciferase的后面，構建熒光素酶質粒。然后轉染至細胞中，通過比較過表達或者干擾miRNA后，檢測報告基因表達的改變（監(jiān)測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用。結合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。 同時，為了減少內在的變化因素，比如：培養(yǎng)細胞的數目、細胞轉染和裂解的效率等對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase）的質粒（phRL-TK）作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄效率的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。在測量過程中，首先加入熒光素酶檢測試劑Luciferase Assay Reagent II時產生螢火蟲熒光信號，這樣先測量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑，將上述反應淬滅，并同時啟動海腎熒光素酶反應，進行第二次測量，稱之為雙熒光素酶報告基因實驗。 下面就介紹一下螢光素酶實驗檢測步驟： 一、樣品準備： （1）細胞鋪板：將細胞按50%的密度接種到細胞培養(yǎng)12孔板內。 （2）轉染：16h左右細胞約70%時轉染螢光素酶報告基因質粒，每個樣品設置3個復孔。首先設計四組：
2.1配制質粒組：按照每空50ng質粒，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，標記為A。 2.2配制miRNA NC/mimics：miRNA NC/mimics的終濃度為20nM，同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，分別標記為B、C。 2.3配制對應轉染試劑：按照每孔0.5μL轉染試劑,同時每孔20ul無血清培養(yǎng)基計算需用量，標記為D。 2.3稀釋好的四組試劑常溫孵育5min。 2.4將稀釋好的質粒DNA和miRNA mimics分別和對應轉染試劑混勻，常溫孵育20min。 2.5將2.4步驟中試劑對應加入孔中。 2.6轉染6h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。 （1）質粒共轉染36-48h后，棄去培養(yǎng)基，用100μL 1XPBS清洗細胞。 （2）傾斜12孔板，吸干剩余的PBS。 （3）去離子水將5XPLB(裂解液)稀釋成1XPLB（現配現用），使用前放到常溫。 （4）每孔加50μL稀釋好的 1X PLB，置搖床振搖20-30min以保證裂解緩沖液完全裂解細胞。 （5）選用白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟4的上清液10μL， 加入100μL預先混好的Luciferase Assay Reagent II，2s后測數據，檢測熒光素酶反應強度。注意此步需在避光條件下進行。 （6）測定結束后，每孔添加100μL預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數據，檢測內參海腎熒光素酶反應強度。 （7）記錄讀數:每個樣品會有3個數值：RLU1—螢火蟲熒光素酶反應強度, RLU2—內參海腎熒光素酶反應強度,計算兩組數據比值，即RLU1/RLU2。 （8）分析數據：比較1、2組可以發(fā)現由于對照組未轉染質粒，因此檢測不到熒光素酶反應強度。比較3、4組，由于轉染microRNA mimics進行microRNA的過表達，螢光素酶的活性降低，提示microRNA可能參與抑制靶基因的表達，需要結合定點突變等方法進一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。 |
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