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慢病毒——基因轉移的潛在新載體 用于基因治療的載體系統可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。目前常用的病毒載體包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等,但是這些載體均存在不足之處,嚴重影響了基因治療的有效性及安全性。在基因治療中廣泛應用的逆轉錄病毒載體存在的主要問題,是無法高效轉導非分裂期細胞,而腺病毒載體雖然能轉導非分裂期細胞,但在體內不能實現目的基因穩定的長期表達,且反復應用容易引起免疫反應。慢病毒載體不但可以感染非分裂期細胞,還具有容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等優點,在基因治療中具有廣泛的應用前景。現以HIV-1 為例,就慢病毒載體的生物學特征、慢病毒載體的構建、在基因治療中的應用以及生物安全性等 方面作一綜述。 一、 慢病毒載體的生物學特征 慢病毒包括靈長類慢病毒,如人 類免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ,以及非靈長類慢病毒如貓免疫缺陷病毒( FIV) 、馬傳染性貧血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和維斯納-梅迪病毒(VMV)等。目 前,HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被廣泛研究用作基因治療的載體,而其中又以HIV-1最為熱門。 1.1 HIV-1 病毒形態與結構 成熟的HIV-1 病毒直徑100～120nm、呈20 面體對稱結構、球形,電鏡下可見一致密圓錐狀核心,內有病毒RNA 分子和酶,后者包括逆轉錄酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。HIV-1的最外層為脂蛋白包膜,膜上有表面蛋白 (gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 兩種糖蛋白,gp120為刺突,gp41為跨膜蛋白。包膜內面為P17 構成的基質蛋白(matrix) ,包膜內為衣殼蛋白(P24)包裹的RNA。 1.2 HIV-1 病毒基因組結構及其功能特征 HIV-1 的基因組由兩條相同的正股RNA 鏈在5′端通過部分堿基互補配對而成二聚體。病毒基因組全長約9200bp ,含有gag、 pol、env3 個結構基因以及tat 、rev、nef 、vif 、vpr 、vpu 6 個調節基因。在病毒基因 組的5′端和3′端各有相同的一段核苷酸序列,稱為長末端重復序列(long terminal repeat ,LTR) 。gag基因編碼p55的蛋白前體,經蛋白酶裂解而形成病毒的核衣殼蛋白(p7) 、內膜蛋白 (p17) 和衣殼蛋白(p24) 。pol 基因編碼病毒復制所需的酶類,env 編碼gp120 和gp41 兩種包膜 糖蛋白,決定病毒感染宿主的靶向性。tat 基因編碼的gp14 是一種反式激活的轉錄因子,與LTR 結合后能促進病毒所有基因的轉錄。rev 基因編碼的產物gp19 能促進未經拼接的大mRNA 分子從細胞核向胞漿轉運,并相對減少拼接后小mRNA 分子的數量。nef 基因編碼負調節蛋白,對病毒的 結構蛋白和調節蛋白的表達均有下調作用。vif 編碼產物與病毒體的感染性有關,vpu 產物與病毒的裝配、成熟和釋放有關,而vpr 編碼產物的功能尚不清楚。 1.3 HIV-1 生活史 HIV-1 病毒通過gp120 與宿主細胞的CD4 分子和趨化因子受體結合,然后將病毒的基因(RNA) 、蛋白及酶等釋放到宿主細胞內;隨后,逆轉錄酶將病毒RNA 轉錄成DNA,病毒DNA 在整合酶的作用下插入宿主細胞核的基因組中,此時的病毒DNA 也稱為原病毒;緊接著,原病毒轉錄成mRNA ,mRNA 從細胞核進入細胞質,并利用宿主細胞的原料合成病毒的各種成分(蛋白質) ,新合成的各種蛋白、酶及RNA 等聚集在宿主細胞的膜下,病毒的包膜蛋白(gp120 ,gp41) 插入宿主細胞的細胞膜并形成一種未成熟的病毒(此時病毒無傳染性) ;最后蛋白酶將病毒核心中的許多過長的蛋白及酶切短,便形成成熟的病毒。病毒利用宿主細胞的細胞膜將自己包被起來,離開該細胞去尋找新的宿主。 1.4 慢病毒載體轉導非分裂期細胞的分子機制 慢病毒載體能轉導非分裂期細胞,3 種分子元件決定了這種能力:MAN、IN 和vpr 。這3 類蛋白利用細胞核的輸入機制,靶向作用于細胞核的前整合復合物( PIC)。細胞核的輸入系統包括: 胞質蛋白、importin-a 、importin-b 及核 孔蛋白。importin-a含有一個細胞定位序列(NLS) 的結合位點,當含有NLS的蛋白與importin-a 結合在一起,發生構象變化,與importin-b 相互作用,然后importin-b通過與核孔蛋白結合,靶向 作用于核孔復合物。而在實際構建時,vpr 可以完全敲除而不影響慢病毒載體感染非分裂期細胞的能力。 二、 慢病毒載體的構建 2.1 早期HIV21 來源的慢病毒載體 早期構建的HIV21 來源 的慢病毒載體,是作為研究HIV21生物特性的工具,而非作為基因轉移載體。該慢病毒載體包含了完整的病毒基因組,僅僅是在env 基因框內插入了一個報告基因,由于存在病毒滴度較低,以及產生有復制能力的反轉錄病毒(RCR) 的巨大風險,這種載體從未被考慮用于基因治療。但是,這種載體可以應用于病毒的生物學研究。 2.2 第一代HIV-1 來源的慢病毒載體 以Naldini以及Kafri構建的三質粒系統為代表。該載體系統由包裝質粒、包膜質粒及載體質粒3 種質粒組成。載體質粒攜帶了5′端LTR 和全部5′端非翻譯區域(包括gag 編碼序列的350 個核苷酸) ,另外還帶有rev 應答元件(Rev responsive element ,RRE) 及3′端LTR。其瞬時表達盒采用巨細胞病毒(CMV) 啟動子及增強子元件,在某些研究領域,可以攜帶綠色熒光蛋白基因、熒光素酶基因或半乳糖苷酶基因作為生物標記。包裝質粒由HIV-1 前病毒基因組作簡單修改得到,其5′端LTR 由異源病毒啟動子/ 增強子元件取代。為了防止來自輔助質粒的RNA 衣殼化, 特意將5′端主要剪接供體位點 (splice donor site) 和gag 編碼序列起始端之間的包裝信號區(E/Ψ region) 刪除,而下游的啟動子由外源多聚腺苷酸信號(poly A)取代。另外,利用點突變將env 編碼序列打斷,但仍然保留rev 反應元件。這樣的輔助結構能表達所有的病毒蛋白,包括tat 及rev(env除外) 。env 由單獨的包膜質粒攜帶并在病毒生產過程中共轉染后表達。本系統包膜質粒的改進之處在于,引入了VSV-G基因表達包膜結構,這樣做的結果至少具有3個方面的積極意義: ①包膜的更換進一步降低了HIV-1 載體恢復成野生型病毒的可能; ②使HIV 載體感染宿主的范圍不再僅限于CD4 + 細胞 ,而擴大到幾乎能感染所有組織來源的細胞; ③VSV 的包膜賦予HIV 載體顆粒高度的穩定性,使其能夠通過超速離心而濃縮,達到高滴度。使HIV-1 載體滴度由105 轉錄單位(TU) / ml 達到 108TU/ ml 。這樣的改進無疑是HIV 載體系統走向應用而邁出的一大步。 2.3 第二代HIV-1 來源的慢病毒載體 盡管第一代載體產生RCR 的幾率極小,仍然不能忽略產生的可能性。畢竟包裝質粒可以表達除env 外所有HIV-1 病毒蛋白,其中部分蛋白與HIV-1的毒力密切相關,且已發現部分蛋白對細胞存在潛在的毒害作用,比如:vpr 可引起細胞周期停滯,vif能抑制某些細胞的生長而Nef 能引起凋亡。1997年,Zufferey 等將包裝質粒上的 vif 、vpr 、vpu 和nef 基因敲除,從而得到第二代慢病毒載體,而其他方面與上述第一代載體系統一致。研究發現即使全部4 個調節基因都被敲除。病毒顆粒的產量也不會受到影響。這種載體仍然具有體外感染非分裂期細胞、在體感染分化成熟大鼠神經元的能力,但是目前尚不能確定這種載體是否能轉染全部種類細胞。由于敲除的調節基因與野生型HIV-1 病毒的生活周期以及毒力密切相關,所以這些載體即使發生多位點重組形成RCR ,親代病毒仍不具有致病性。 2.4 第三代HIV-1 來源的慢病毒載體 利用慢病毒來源的包裝系統的最大問題在于生產過程中可能產生復制型病毒。當質粒DNA 轉染進入包裝細胞,以及輔助質粒及載體質粒的RNA 包裝入同一病毒顆粒時,將有可能發生重組。減少這種可能性的方法之一就是減少輔助質粒與載體質粒的同源性。另一個方法便是將gag/ pol 和rev 編碼序列隔離,分散在不同的質粒 。這樣的包裝系統需要四質粒來代替原有的三質粒包裝系統。質粒一攜帶了gag/ pol 編碼序列 及RRE;質粒二包含了編碼rev 的序列;質粒三是載體質粒;質粒四表達env。采用四質粒代替三質粒系統、除去tat 均減少了產生復制型病毒的可能性,從而增加了載體系統的安全性。 2.5 自身失活型(SIN) 慢病毒載體 由于具有逆轉錄方式的特點,在逆轉錄過程中存在于病毒基因組3′端U3 區的啟動子/增強子元件將被復制,并置于前病毒兩端的LTR。 因此,3′LTR 的U3 區啟動子發生失活突變后,將在逆轉錄過程中轉移至5′LTR。如果這樣的載體整合入靶細胞,將不會產生完整長度的載體RNA ,因此命名為“自身失活型載體”。這種技術最先應用于莫洛尼氏小鼠白血病病毒(MoMLV) 載體和鳥類的脾壞死病毒(SNV) 載體。進一步研究表明 ,U3 區的頻繁突變將導致病毒滴度下降,原因是該區域的某些序列是載體有效多聚腺苷酸化所必需的。在HIV-1 基因組內,核心多聚腺苷酸化信號存在R 區。現已證實,U3 區序列能影響多聚腺苷的酸化效率。與MoMLV 相比,將HIV-1的3′LTRU3 區(除上述多聚腺苷酸化增強相關序列,以及病毒整合酶識別的U3 區5′末端外) 刪除后并不會影響滴度。這種刪除能確保病毒RNA 逆轉錄并整合入靶細胞染色體后,從5′LTR 端啟動子起始的復制被有效抑制。這種設計的另一個優勢是 能增強瞬時表達效率,這可能與減少了病毒LTR 和細胞啟動子之間的啟動子競爭有關。 2.6 其它類型 在改進慢病毒載體生物安全性的同時, 科學家們在基因轉移效率方面對病毒載體做了一些改構,以期提高目的基因的轉導效率及在靶細胞中的表達效率。Zufferey 等將美洲旱獺肝炎病毒的翻譯后調節元件(WPRE) 插至載體3′末端 。翻譯后水平WPRE可以促進轉錄物出核,還可以通過上調初級轉錄物的多聚腺苷化,來增加胞內信使RNA 總量,最終改進轉移基因的表達效率。另外,科學家嘗試在SIN 載體中修復118bp 的cPPT序 列,發現在分化與非分化靈長類動物細胞中,載體轉導效率顯著提高。 三、 慢病毒載體的包裝 大部分研發人員目前都使用瞬時轉染293T 細胞的方式生產病毒載體。這種方法的缺點在于生產獲得的病毒載體可能會出現有缺陷的基因組。為了生產高質量的載體,必須篩選合適的包裝細胞系,而建立包裝細胞系的最大難點在于某些病毒蛋白具有細胞毒性。比如, vpr 能誘導細胞停滯在G2期,不利于建立vpr 蛋白高表達的細胞系,病毒蛋白水解酶同樣能水解細胞內的蛋白,不利于建立穩定表達病毒gag-pol 蛋白的細胞系;VSV-G蛋白的表達同樣對細胞具有毒性。目前,為了建立合適的慢病毒載體包裝細胞系,許多科學家都在嘗試使用誘導型或可調節的啟動子來克服病毒蛋白的細胞毒作用。 四、 慢病毒載體滴度的測定 慢病毒載體滴度可以參考腺病毒載體滴度的檢測方法,將病毒與293 細胞共培養后,通過流式細胞儀檢測GFP 蛋白表達水平來分析病毒滴度,病毒滴度為表達GFP 的細胞數乘以相應稀釋倍數。另外,還可以通過TaqMan PCR 檢測細胞中病毒拷貝數的方法檢測滴度。 五、 復制型慢病毒(RCL) 的檢測 應用慢病毒的基因載體的首要問題就是復制型慢病毒(RCL) 的產生。雖然現在還沒有明確的指導方針,但是目前多個國家都制定了復制型逆轉錄病毒(RCR) 的檢測方法。在實驗室研究領域,科學家提出通過將病毒載體與293 細胞等指示細胞共培養,293 細胞傳數代后檢測細胞中是否含有gag 序列的方法來確定是否存在RCL 。如果收集的病毒載體不含有RCL ,則與293 細胞共培養后不發生增殖,gag序列檢測即為陰性。另外,還可以應用更為敏感的RT-PCR 檢測gag 及VSV-GRNA 判斷293 細胞上清中是否含有RCL 。 六、 慢病毒載體在基因治療中的應用前景 6.1 獲得性免疫缺陷綜合征的基因治療 目前對于AIDS 的基因治療方案,基本上是由反轉錄病毒載體將抗病毒基因體外導入CD4 + T 淋巴細胞或CD4+ 的造血祖細胞,再回輸體內。常用的抗病毒基因包括自殺基因、反義RNA、核酶、RNA誘餌的相應DNA序列,以及調節蛋白或結構蛋白的突變體基因等。由于這些治療基因不能到達巨噬細胞和多能干細胞,因此難以重建免疫;此外,體外操作費用昂貴,不適于大規模應用。 HIV-1 載體的研究為AIDS 的基因治療帶來了新的希望,它可能具有以下優勢:第一,HIV-1 自身的包膜蛋白env 包裹的載體顆粒可以將抗病毒基因直接運抵CD4 + T 淋巴細胞和巨噬細胞,適于直接的體內治療,而包被了VSV 包膜的載體顆粒又能感染多能干細胞,有利于免疫重建;第二,患者體內的野生型HIV-1 可將攜帶抗病毒基因的HIV-1 載體拯救出來,使載體擴增并擴散到周圍更多的細胞中發揮抗病毒作用;第三,如果將抗病毒基因置于HIV-1 本身的長末端重復序列(LTR) 控制之下的轉導細胞,則只有當HIV-1 感染該細胞時, tat 蛋白反式激活LTR中的TAR元件,抗病毒基因才會表達,使基因表達具有了靶向性。 6.2 神經系統疾病的基因治療 帕金森氏病是一種由于大腦紋狀體內多巴胺水平降低而引起的退行性腦病,臨床上以注射左旋多巴改善癥狀,但長期注射的不便及藥物的副作用令患者難以承受。較為理想的治療方式是在腦內持續表達酪氨酸羥化酶(TH) ,使其催化酪氨酸轉變為為左旋多巴;Alzheimer 氏病也是一種多因素引起的退行性腦病,造成大腦皮質和海馬回神經元萎縮,通常采用神經營養因子防止神經元退化。由于HIV-1 載體能夠體內轉導神經元并建立長期穩定的表達,因此上述疾病的慢病毒載體基因治療將極具潛力。應用慢病毒載體進行膠質源性神經營養因子(GDNF) 、酪氨酸羥化酶(TH) 體內基因治療,可改善PD 大鼠的旋轉次數,保護多巴胺能神經元、防止神經元退化,起到治療帕金森氏病及Alzheimer 氏病的效果。 6.3 血液系統疾病的基因治療 Pawliuk 等構建的βA珠蛋白基因變體βA-T87Q能阻止HbS 的多聚化,以HIV-1載體將該基因轉染人造血干細胞,并能在人紅細胞系可以表達。在鐮狀細胞貧血(SCD) 小鼠模型移植人造血干細胞后,轉基因獲得長期表達,在循環血中99 %的紅細胞及52%的血紅蛋白有紅系特異性轉基因表達,鐮狀細胞貧血得到改善,血液學指標、脾臟腫大及特征尿濃縮功能缺陷得到糾正。May 等構建含人β珠蛋白啟動子和增強子調控的人β珠蛋白基因的HIV-1 載體,在載體轉染的MEL 細胞中,正常β珠蛋白可達到正常內源性β珠蛋白產量的70 %以上,使Β-地中海貧血得以較好的糾正。Yamada 等將Fanconi 貧血(FA)C 型患者的EB 病毒刺激轉化的原始淋巴細胞作為靶細胞,用HIV-1 載體將FAC 型cDNA轉入靶細胞,用絲裂霉素C藥物抗性監測FA細胞表型的糾正情況,效果顯著。慢病毒載體以其獨特的優勢,在血友病的基因治療中有較好的應用前景。Park 等構建EF-1α增強子/ 啟動子調控hFⅧ或hF Ⅸ表達的HIV-1載體,經門靜脈注入C57BL/6 小鼠,其血清hF Ⅸ水平隨著載體數量的增加而增高,最高可達50～60 ng·ml - 1 ,這表明慢病毒載體在體內可以產生治療水平的凝血因子。目前,少數國外研究機構已經開展以慢病毒載體為基礎的基因治療臨床試驗研究。 6.4 肝臟疾病的基因治療 肝臟的基因治療策略通常是“增加基因”,通過導入正常的基因,代替缺陷或缺失的內源基因起到治療作用。如苯丙酮尿癥、酪氨酸血癥、Wilson′s 病和LDL受體缺陷癥等。Nguyen 等證實了來源于第三代HIV-1 載體能夠有效的控制傳遞、整合、穩定表達轉基因進入人原代肝細胞。可以預計,利用慢病毒載體來介導治療基因進入肝細胞內,將起到一定療效。 6.5 其 他 最近,Goldman 等用HIV-1載體進行了嘗試,動物實驗表明,導入CFTR 基因后囊性纖維化(CF)缺陷可被糾正。但同時也發現,HIV-1 載體轉導分化中的呼吸道上皮細胞效果較好,而對完全分化的上皮細胞的轉導效率則非常低。目前尚不完全清楚轉導受限的機制。色素性視網膜炎是一種遺傳性的進行性視網膜退變,癥狀包括視野進行性減小、夜盲、視網膜色素沉著等。研究發現, 將視桿細胞cGMP磷酸二酯酶-γ亞單位基因導入感光細胞,有可能糾正視網膜退變。由于成熟的視網膜細胞絕大部分為終末分化細胞,在選用載體系統上受到很大限制,慢病毒載體以其轉導非分裂期細胞的能力,給該疾病的治療帶來了希望。 七、 生物安全性 慢病毒載體安全性方面最令人關注的是重組產生具有復制能力的逆轉錄病毒(RCR) 。病毒載體顆粒通過包裝元件和含病毒基因組質粒共轉染包裝細胞系如人類胚胎腎細胞而產生,病毒載體顆粒的核心和酶的成分來源于HIV-1 ,衣殼來源于另一病毒,最常見的是VSV ,其產物G蛋白具有高度的穩定性和廣泛的親嗜性。最新一代的慢病毒載體(第3 代)只含有HIV-1共9 個基因中的3個,即gag、pol 、rev。由于HIV-1基因組成分中60%被去除,因此父代病毒無法復制,載體本身只是將目標基因轉移到靶細胞內的工具。利用逆轉錄機制構建自我失活(SIV)的HIV-1來源的載體,一旦轉移到靶細胞后,它就喪失了病毒長末端重復的轉錄能力,減少了產生重組病毒的機會,并避免了與啟動子干擾的問題。以HIV-1 為基礎的第3代慢病毒載體系統的安全性甚至超過了目前臨床試驗正在使用的致癌性逆轉錄病毒載體。 八、 結 語 迄今種種努力表明,在保證HIV-1 載體安全性的基礎上,要產生有復制力的HIV ,必須在不同的質粒上發生多次非同源重組事件。總之,慢病毒載體在基因轉導方面的良好特性,必將成為基因治療的有力工具,值得進一步深入研究。
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