熒光原位雜交技術(FISH)的基本原理及應用

       在FISH技術問世之前，基于20世紀60年代，放射性核素探針的原位雜交方法，檢測間期染色體和分裂期染色體上特定DNA和RNA序列的方法，該方法存在操做比較麻煩、分辨率有限、探針不穩定、放射性同位素的危害較高等問題，故目前棄之不用。20世紀80年代用非放射性半抗原如生物素進行核酸標記的技術逐漸開展后，探針也開始使用這種非放射性標記方法。隨后FISH技術逐漸開展起來，1986年以后該技術被應用于分析細胞分裂期染色體鋪片的DNA序列。相對于放射性來說，FISH具有穩定性好、操作安全、結果迅速、空間定位準確、干擾信號少、一張玻片可以標記多種顏色探針等優點。這些優點逐漸使FISH成為一種研究分子細胞遺傳學很好的方法。

     FISH即染色體熒光原位雜交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通過熒光素標記的DNA探針與樣本細胞核內的DNA靶序列雜交，從而獲得細胞核內染色體或基因狀態的信息。FISH是將傳統的細胞遺傳學同DNA技術相結合，開創了一門新的學科——分子細胞遺傳學。（如下圖所示)

       目前臨床上用于FISH檢測的探針的熒光素大都是綠色的和橙紅色標記，可大致分為：染色體計數(著絲粒)探針(centromere-enumeration probes，CEP)，位點特異性識別探針(locus-specific identifier probes，LSI)，染色體涂染(paint，WCP)探針。其中CEP和LSI探針中的計數探針、融合探針及分離重排探針，在血液病診斷與預后分型中最為常用。比如骨髓增生異常綜合征(MDS)中8號染色體數目會增加;又或者多發性骨髓瘤(MM)中IGH基因的結構重排和AML-M3中的PML/RARA融合基因。檢測的結果可以是擴增、缺失、融合、斷裂等。

       通過標記某條染色體或者是某個基因特有的特異性DNA片段，與目的基因相結合，從而產生熒光雜交信號。由于正常人的染色體是二倍體，那么正常人的檢測信號就是兩個，當信號多于兩個或者少于兩個(排除切片影響)，該染色體或者基因就異常(擴增或缺失);如下圖8號染色體三體。

         含有用兩種不同顏色熒光素標記的探針(一般用綠色和橙紅色兩種)，分別對應兩個獨立的靶基因位點，當兩個獨立的靶基因位點相互融合就會形成典型的兩個融合信號(黃色)和一個正常的綠色信號及一個正常的紅色信號;如下圖慢性粒細胞白血病BCR/ABL融合基因形成模式圖。

        某基因發生重排時會在相對恒定位置斷開，通過不同顏色熒光素標記斷裂點兩端特異性的DNA片段，該基因沒有發生重排，紅色和綠色靠近會發生混合色形成黃色;如果發生斷裂，則形成單獨的顏色(如單獨的紅或綠)，當然，重排探針同樣能夠提示數目異常(如多倍體)。如下圖IGH基因的重排。

注：部分圖片素材來自雅培官網

       1)指導靶向藥物的使用，如乳腺癌赫賽汀(HER2)、肺癌克唑替尼(ALK/ROS1/CMET);

       2)指導腫瘤預后，如腦膠質瘤的預后(1p和19q缺失)、神經母細胞瘤和分化型神經母細胞瘤(NMYC)。

        1)明確診斷，如急性早幼粒白血病：t(15;17)，慢性粒細胞白血病：t(9;22)，套細胞淋巴瘤：t(11;14)，Buikitt淋巴瘤：c-MYC基因重排;雙打擊及三打擊淋巴瘤：MYC，BCL2，BCL6。

       2) 血液腫瘤，如急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征、多發性骨髓瘤等進行危險分層。

表1 骨髓增生異常綜合征常見FISH檢測意義

表2 慢性淋巴細胞白血病中常見FISH檢測意義

表3多發性骨髓瘤中常見FISH檢測意義

注：歐洲骨髓瘤工作組推薦MM患者要做漿細胞CD138分選后相關FISH檢查

        3)檢測染色體隱蔽易位或常規細胞遺傳學不能發現的異常。

       4)微小殘留病定量和分析大量分裂和不分裂細胞，評估細胞遺傳學緩解和復發（靈敏度不如實時定量PCR）。

       FISH技術一般用于了解基因或染色體發生擴增、缺失、融合或斷裂，只需分析間期細胞，每次可分析間期細胞500-1000個，不受細胞是否分裂的影響，能更好地全面判斷患者某種染色體異常比例。由于使用的是特異的探針，使人為的判斷誤差大大減小。根據熒光信號判斷結果，比染色體分析獲得結果更加快速，重復性好。

        樣本來源廣泛：組織、脫落細胞、羊水、血液、骨髓都可以檢測，且不僅局限于新鮮樣本，石蠟包埋樣本也可以檢測。