|
為什么說BMJ是一本神奇的雜志？對于做腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移實驗的“科研民工”而言，細胞劃痕實驗是再熟悉不過了。但是再簡單的實驗也會栽跟頭，這不，因為粗心大意，我前后做了兩周多的無用功，在此，基于自己失敗的教訓(xùn)，給大家做一點總結(jié)。
我為什么會選擇做細胞劃痕實驗？
1）一定程度上模擬了體內(nèi)細胞遷移的過程； 2）適合研究細胞與胞外基質(zhì)（ECM）、細胞與細胞之間相互作用引起的細胞遷移。 3）與包括活細胞成像在內(nèi)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，可用于分析細胞間的相互作用。 4）簡單、便宜。（重中之重） 要準備哪些材料？
做細胞劃痕實驗，基本上不需要額外買設(shè)備，準備：細胞樣品、6孔板（基于個人實驗需要）、marker筆、直尺、槍頭、試劑、無血清培養(yǎng)基、PBS，所有需要的器材都要滅菌，超凈工作臺紫外線消毒至少30min。
該實驗一般適用于上皮，纖維樣細胞系，本身有遷移能力，且較強；有極性，方便測量，觀察；對無血清有較強的忍受力。
操作步驟？
1）我習(xí)慣于在六孔板背面每隔1cm畫上一條直線，方便之后鏡下觀察每個區(qū)域。每個孔加入5*105個細胞（可以根據(jù)牛鮑計數(shù)板確定自己合適的稀釋倍數(shù)）
注：數(shù)量以過夜貼壁能鋪滿為宜，適當(dāng)調(diào)整；數(shù)量少時可培養(yǎng)一段時間至鋪滿板底。這就第一個坑，第一次做這個實驗的時候，并沒有理解鋪滿到底有多滿，一定要等到細胞鋪滿，彼此之間沒有空隙，否則會影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
2）待細胞鋪滿后，用200ul槍頭垂直于孔板和線制造細胞劃痕，盡量保證各個劃痕寬度一致, 人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實驗結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學(xué)可以選擇culture Insert（如下圖），將細胞接種于Dish中間的Insert，培養(yǎng)。細胞長滿Insert 區(qū)域后用鑷子移除Insert即可產(chǎn)生500um寬度的劃痕
不過我查了一下價格，有一丟丟小貴，所以還是選擇了槍頭代替，其實多練幾次，效果也是不錯的，捂臉說到底還是為了省錢。 3）吸掉舊培養(yǎng)基，用無菌PBS沖洗細胞3次，去除劃下的細胞后，再加入無血清培養(yǎng)基，根據(jù)需要設(shè)加實驗組、對照組。
注：沖洗時溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細胞，反復(fù)多次沖洗，盡量洗掉所有的細胞碎片，否則會影響拍照效果。
4）放入37度5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12，24小時拍照（觀察時間根據(jù)個人實驗需要）。一般為上述時間，時間太久，細胞繁殖，假陽性。
注：這是第二個坑，一般情況下，大家都會設(shè)置對照組和實驗組，實驗組都是加了各種抑制或促進細胞增長的藥物，建議不要把觀察時間設(shè)置的太長，因為很容易造成細胞污染死亡或者過度增殖造成的假陽性結(jié)果。
5）圖像數(shù)據(jù)分析。我習(xí)慣于用Image Pro Plus進行分析，其實ImageJ也是可以的。打開軟件，點擊file→open，選擇你需要處理的圖片（HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細胞）。
選擇區(qū)域之前，可以先對圖片處理一下，加強細胞的輪廓。點擊process→filters→edge→sobel→點擊apply，效果如圖所示。 中間黑色的劃痕區(qū)域可以用描繪工具中的魔棒工具來選擇。點擊irregular AOI→NEW AOI，圈選中間黑色的劃痕區(qū)域。 接下來開始測量，除了測量面積之外，還可以測量外框長度，也就是劃痕的長度，也就是圖片的整體高度。點擊count/size→measure→select measurements→Box Height（這就是劃線的長度）。 點擊edit→convert AOI(s) to Object(s) →view→meaurement data。 劃痕的平均寬度=Area/Box Height，例如圖中數(shù)據(jù)654727/1200≈545.61
注：一個要注意的問題，隨著細胞的不斷遷移，劃痕會不斷縮小，在計算不同時間點劃痕寬度的縮小時，不要計算其相除的比例值，而是要計算想減的差值。
好了，今天就策到這里，希望對大家有幫助。 |
|
|
