文獻精讀（多組學聯合分析）：Integrative analysis of genomic and epigenomic regulation of the transcriptome in liver cancer文章關鍵詞：肝癌，DNA甲基化，組蛋白修飾，轉錄組
近年來聯合多組學分析已經成為表觀領域的研究熱點，利用單一組學數據分析致病因子的局限性愈發顯著。通過多組學聯合分析將有助于人們更加系統全面的認識腫瘤的生物學行為，進一步為尋找有價值的腫瘤標志物和探討腫瘤相關機制提供新的線索。這篇NC文章聚焦在了肝癌這個腫瘤上面，看看組學分析能夠得到什么有意思的發現呢？
一、Summary
作者從以轉錄組的數據入手，結合基因組數據和表觀數據進行差異分析?？茨懿荒苷业脚c肝癌的發生發展密切相關的異?；蚧蛘呤峭?。 主要研究思路和結論是： 1.分析64個肝癌病人樣本，通過尋找DNA甲基化（MET cor）和DNA拷貝數變異（CNV cor）差異表達基因，證明了異常的MET cor和CNV cor的基因有些顯著的共調控作用。 2.進一步研究，能否根據 MET cor和CNV cor進行肝癌分型，將已有的肝癌樣本分為三個亞型。并且在TCGA數據庫中進行驗證（NMF算法） 3.篩選對HCC侵襲性影響最大的基因變異BAP1，對腫瘤的侵襲有著至關重要的作用，而且在 Huh7細胞轉染實驗進行驗證 帶著問題去思考： 1：為什么選擇肝癌？
2：作者是怎樣找到這些異常的DNA甲基化基因和拷貝數變異的基因的？
3：如何去證明這些基因的共調控作用呢？既然共調控，調控的機制是什么？（或者是說如何去聯系DNA甲基化和拷貝數變異的？）
4：是如何對肝癌進行分型的呢？分類結果如何顯示呢？怎么驗證？
5：如何篩選功能最顯著表達差異的基因（如何篩選到BAP1?） 二、Introduction
1:DNA甲基化和拷貝數變異發生在腫瘤的侵襲中 2：肝癌是重大公共衛生問題，中國尤甚；同時對于肝癌來說，基因組和表觀組的異質性大，簡單介紹一下今天的主角：肝細胞癌（Hepatocellularcarcinoma， HCC），全球惡性癌癥死因“惡名榜”第二。中國是HCC的重災區，不僅“貢獻”50%的全球HCC新發和死亡病例，且平均年齡55-59歲比國外HCC低發國家早近20年[1,2,3]。 3：在之前的研究中，一些癌癥相關的基因通過DNA甲基化去發揮功能作用，如 IGF2 UHRF1這些基因 4：收到DNA甲基化和拷貝數變異的影響，既然都可以影響轉錄，那么他們之間有沒有協同作用呢？這方面的研究還不是很清楚 5：一共用了64個肝癌的CNV,MET,EXP樣本信息
三、Result3.1 Transcriptome deregulation by DNA copy number or methylation(DNA甲基化和拷貝數變異會導致轉錄失調) 
b.在a圖的基礎上，需要找到差異顯著的那些基因，然后|r|>0.5，也就是紅圈圈的位置，然后發現了CNVcor有813個，METcor有321個。把這幾個基因集進行求交集發現了只有24個overlap基因.
ps:拿到這些基因做了一個富集分析，發現CNV差異基因富集在蛋白相關的信號通路上，MET的差異主要富集在炎癥反應等上面
c. CNV基因顯示出了它的一個基因組偏好性，比較集中在8號染色體上。DNA甲基化的基因在全基因組上分布沒有偏好性。 d.（左圖） 發現DNA甲基化的基因一般都分布在inter-genic(基因間區)而不是CpG島。（右圖）發現DNA甲基化更偏向于發生在基因body區域，推測開放區域的甲基化可能會導致轉錄異常，芯片中CpG島的表達方式N_shore,N_shelf等。 e:計算每個病人樣本的CNVcor上調和下調的基因個數，METcor上調和下調的個數。然后畫出e的柱狀圖。（不同顏色代表上下調的基因）下面那個熱圖的意思就是說紅色的上調的，藍色的是下調的基因位點。 f:去尋找CNVcor上調和下調基因和METcor上調和下調的相關性。每個點代表著一個病人樣本。橫縱坐標代表這個病人的差異基因的個數，然后做了一個相關性分析。
Q:這整個一個大Figure說明了什么？ A:個人認為是確定DNA甲基化和拷貝數變異適合轉錄組異常相關的，至于有多么相關，數據給出信息。 3.2 Molecular subtype based on CNVcor and METcor genes對于CNV和MET差異表達基因可以用于肝癌的分子分型 
【這是無監督學習算法的一種，和k-mean，分層聚類等目的一樣，為了把這些樣本進行分類。感興趣的可以看看： https://blog.csdn.net/google19890102/article/details/51190313】對CNV和MET基因進聚類，然后得到的結果，OS 是overall survival（總體生存時間），TTR是time to tumor recurrece（腫瘤復發時間）。發現對于CNV分類來說可以把這些樣本分成3類，用MET分類的話可以分成4類。而且從分類效果OS,TTR來看CNV的分類效果更好。
【iCluster：一種可以利用R包進行分類的分類方法，詳情可以見：http://www./packages/devel/bioc/html/iClusterPlus.html】 c:熱圖顯示了iCluster分析鑒定的亞型表達模式。使用NMF聚類方法鑒定的CNVcor或METcor基因的亞型的比較，每個亞型鑒定的結果用彩色條形標記。每個亞型中CNVcorup、CNVcordown、METcorup、METcordown 基因的異常表達頻率如圖(最底下)所示。中間的是熱圖。
d:用K-Mean的方法畫出利用icluster方法分類的這種類型的OS,TTR曲線，看看分類效果。
【作者比較了iCl1，iCl2和iCl3亞組的臨床病理特征，發現iCl1腫瘤比iCl2或iCl3的侵襲性更強（P = 0.002，表1）。 其他臨床特征在亞組之間沒有差異。 這些結果與分子亞型的獨特侵襲性特征一致。 基于這些發現，CNVcor和METcor基因的綜合分析可以識別分子亞型，每個分子亞型具有與轉錄失調相關的基因組和表觀基因組特征的不同組合，與不同的預后結果相關?！?/span>
Q：得到了這個分類結果，相當于一個訓練集，那么如何驗證這個訓練集的分類效果呢？ A：利用數據庫，大樣本庫的數據進行驗證
3.3 Validation of the molecular subtypes in an TCGA data set
Validation of the molecular subtypes in an TCGA data set.png
a:觀察到CNV和轉錄組之間的相關系數的總體分布向右偏，MET左偏， b,c:尋找差異的基因，求交集，發現CNVcor基因在8號染色體進行富集和之前一致 d.e: METcor基因在open sea區域和gene body域比在CpG島和TSS區域富集更頻繁 此外，異常CNVcor和METcor基因的頻率之間的相關性也得到驗證，相關性0.82. f,g :分類效果，C1組DNA拷貝數和DNA甲基化畸變率最高，C3組最低 h：OS,RFS分析圖
Q:發現利用CNV和DNA甲基化是可以用作分子分型的，大樣本也重復出來了結果，接下來如何分析呢？如何去找DNA甲基化和拷貝數變異的關系呢？ A:我們接下來看看作者如何借助統計學去試圖尋找答案 3.4 Coordinated aberrations of DNA copy numbers and methylation整合DNA甲基化數據和拷貝數變異數據
圖a,b整合了TCGA的數據和他們自己已有的數據進行分析。 在C圖中，我們可以看到橫坐標是CNV頻率，縱坐標是 MET頻率，可以看出他們有顯著的相關性 在圖d,e,f,g中，分別以CNV gain ,CNV lose，MET gain ,MET loss進行坐標變換。然后都發現他們的之間的相關性與橫縱坐標軸的變量變化無關。 總之，我們認為頻繁的DNA拷貝數異常的HCC患者更可能經常出現DNA甲基化異常。 異常CNVcor和METcor基因的這些相關頻率可能意味著DNA拷貝數和DNA甲基化的異常之間的密切關系。
3.5 Identification of genomic key features in the HCC subtypes
a:TCGA中肝癌的數據樣本分析，剔除了同義突變后，篩選出在189個發生10次以上突變的重復突變基因，我們鑒定出37個差異突變基因，其中> 5%的突變頻率在C1、C2、C3亞型之間存在差異（其中有2個肝癌樣本沒有基因組突變數據），發現了BAP1是C1突變的最頻繁的基因。CTNB1是C2、C3當中突變最頻繁的基因，而且和腫瘤的發展高度相關
b:GeneMania軟件做的圖（基因間相互作用的，可以在cytocsape里面裝這個插件，也可以去分析網站GeneMANIA，網址：http://），為了找到亞型的功能決定區域，利用SNU和TCGA數據交集CNVcor genes (n = 95) and METcor genes (n = 179)進行分析，發現了UBC 這個基因在CNV基因集中相關系數很高。（越靠中心說明了越重要）
c:先對這兩個基因集求一下交集，找到相同的差異的上調或者下調的基因。舉個例子來說：CA9是iCl1/C1腫瘤中上調表達差異最大的基因。（CA9是缺氧的一個標志物，其過表達在HCC中是一個不好的預后標志物。此外，與其他亞型相比，侵襲性iCl1和C1腫瘤表達了高水平的干細胞相關基因，如KRT19、EPCAM和PROM1。與Rhee, H等人報道的CA9的表達與HCC中干細胞相關表型相關的結果相符[4]。）
基于這個可能和干性有關的特性，進一步評估已知的和干性相關的基因集(即ESC、Nanog、Oct4、Sox2、Myc1、Myc2等已知的和細胞干性相關基因集)。在熱圖中，黃色代表高表達，藍色代表低表達，發現在IC1,C1中這些干性的基因集高表達了。說明和這些差異表達的基因和腫瘤干性有關系。 作者將這次分類結果與之前定義HCC亞型分子分型的研究進行了比較。發現二者overlap。這也意味著這些以前的分類的表達可能與CNVcor和METcor基因畸變的頻率有關。 （PS:腫瘤干細胞(CsC)理論認為腫瘤的發生、發展、轉移和復發與CsC密切相關,對CSC的研究已成為腫瘤研究的熱點。自我不斷的更新復制以及保持分化的潛能是干細胞的特性。Sox2、Nanog等轉錄因子是維持干細胞干性的核心轉錄因子，那么有關于這些轉錄因子的表達情況是作者探究肝癌細胞是否具有干性的核心關注點。） 綜上所述，這些發現提示，與DNA拷貝數和DNA甲基化相關的HCC分子亞型也與BAP1和CTNNB1突變有關，這可能在HCC亞型進展中發揮調控作用。對于分類結果來說，我們認為C1和iCl1腫瘤可能具有這些亞型的共同功能特征，如侵襲性或干性。我想知道為什么這里分析出兩個突變，后面只驗證了一個：因為C1是惡性程度最高的HCC，所以更關注BAP1，另外一個就不詳細研究。
d:展示了BAP1抑制對肝癌細胞干細胞基因表達的影響。Huh7細胞通過轉染以BAP1 shrna，下調BAP1的表達，發現了包括CA9、KRT19、EPCAM、PROM1在內的stemness基因的顯著上調表達。這些結果有力地支持了我們的發現，即BAP1突變可能至少在一定程度上促進了一種侵襲性HCC亞型表達。
這篇文獻的主圖基本上就講到這里了。看完之后思考之前的問題：
1：為什么選擇肝癌？ 因為肝癌在全球的發病率死亡率非常靠前，而且CNV和MET異質性比較大。研究既有實際意義又有可行性。 2：作者是找到這些異常的DNA甲基化基因和拷貝數變異的基因的？
3：如何去如何起證明這些基因的共調控作用呢？既然共調控，調控機制是什么？（或者是說如何去聯系DNA甲基化和拷貝數變異的？） 4：對肝癌進行分型是如何分的？分類結果如何顯示呢？ 5：如何篩選功能最顯著表達差異的基因（如何篩選到BAP1?） 文獻thinking: 2：關于基因組分布的偏好性，作者并沒有給出一個合理的解釋。可以多往這個方面多挖掘一些信息。 3：還有一些點可以深挖掘，比如說找到了一下表達差異相關的基因，那么這些基因在表觀上有沒有其他的作用，（雖然有討論Bap1和H3K27me3的關系），比如說是不是和組蛋白修飾或者是ncRNA有關？
4：找到的這些significant基因當診斷的marker是否可行（或者治療靶點）？ 5：DNA甲基化和CNV的相關性問題，既然找到了CNV_DOWN和MET_DOWN有正相關，圖一f中，是不是可以繼續挖下去呢？進一步解釋一下DNA甲基化和CNV之間的是如何影響的呢？畢竟文章只是說存在相關性。
參考文獻 原文鏈接：https://www.ncbi.nlm./pubmed/29018224 1：Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet‐Tieulent J, Jemal A. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin. 2015;65:87‐108. 2：Hindupur SK, Colombi M, Fuhs SR, et al. The protein histidine phosphatase LHPP is a tumour suppressor. Nature 2018, 555, 678‐682. 3：MALEK NP, SCHMIDT S, HUBER P, et al. The diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Dtsch Arztebl Int, 2014, 111(7): 101-106. DOI:10.3238/arztebl.2014.0101. 4: Rhee, H. et al. Poor outcome of hepatocellular carcinoma with stemness marker under hypoxia: resistance to transarterial chemoembolization. Mod. Pathol. 29,1038–1049 (2016) 排版：小丸子 文章來源于：sci666 |
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