基于藥效物質基礎的熟地黃質-效評價研究進展

地黃系玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch. 的新鮮或干燥塊根。《中國藥典》2015年版^[1]收載了地黃（鮮地黃、生地黃）及其炮制品熟地黃，其生熟之品性味功效迥異。鮮地黃性寒，味甘苦，具有清熱生津、涼血止血之功效；生地黃是鮮地黃經過烘焙至約8成干而成，性寒，味甘，具有清熱涼血、養陰生津之功效；熟地黃是生地黃經過酒燉或蒸制而成，性溫，味甘，具有補血滋陰、益精填髓之功效。三者之間藥性迥異^[2]歸因于在加工炮制過程中其化學成分種類和含量發生變化。

熟地黃的炮制加工方法^[3]始載于南北朝雷敩的《雷公炮炙論》，炮制方法發展至今，由最初的2次蒸曬發展到九蒸九曬，再從單一輔料（酒）的炮制演變至多種輔料（酒、砂仁、茯苓等）的反復蒸制，直到現行標準又簡化為一次性蒸制和酒燉，熟地黃制法各異，主要為加工方法和所用輔料、蒸制次數及時間等方面的不同。傳統九蒸九曬地黃炮制品^[4]不僅具有“黑如漆，亮如油，甘之飴”的優點，而且在炮制中借黃酒行散之力以增強熟地黃通血脈、補血的功效；同時地黃通過反復蒸曬，使其厚重之氣得以散失，克服了濕膩之性，增強了補益的功效。現今大都仍遵循“光黑如漆，味甘如飴”的質量評價標準，以“九蒸九曬”為達到炮制終點的制作要求和理想狀態，同時還需符合“太過則性味發酸”的準則^[5]。為保證熟地黃的質量穩定性，必須建立科學完備的質量評價體系，《中國藥典》2015年版鑒別項下以薄層鑒別毛蕊花糖苷來鑒別熟地黃，含量測定項下以毛蕊花糖苷質量分數不少于0.020%為限量，評價方式較為單一。近年來，國內外學者在熟地黃的化學、藥理、炮制等方面做了大量研究工作，為熟地黃的質-效評價奠定了基礎。為更加明確熟地黃的藥效物質基礎，全面揭示熟地黃炮制的科學內涵，本文通過查閱文獻，對熟地黃化學成分、藥理作用、炮制研究進行綜述，并展望了結合效應代謝組學，從化學、藥理、不同炮制程度等角度全面評價熟地黃質量，以期為熟地黃的質-效評價和炮制終點的確定提供新的思路。

1  熟地黃炮制前后化學成分變化

地黃經炮制后化學成分發生了一定的變化，開展熟地黃化學成分的相關研究是探究其多種藥理作用的基礎，也是從化學角度探索熟地黃質量評價方法的前提。

1.1  環烯醚萜及其苷類化合物

地黃中環烯醚萜及其苷類化合物^[6]主要有梓醇，乙酰梓醇，益母草苷，地黃苷A、B、C、D，地黃素等。地黃中的地黃苷A、D的含量比熟地黃高，梓醇為鮮地黃中含量最高的環烯醚萜苷，在加工炮制后其含量有所下降。據報道^[7]，9次蒸曬后，熟地黃中益母草苷、密力特苷的含量降低，梓醇和桃葉珊瑚苷含量急劇降低。

1.2  苯乙醇苷類化合物

地黃中苯乙醇苷類成分^[8-10]主要有毛蕊花糖苷、紅景天苷、焦地黃苯乙醇苷D、焦地黃苯乙醇苷A1、焦地黃苯乙醇苷、異地黃苷、purpureaside C、darendoside B、decaffeoylacteoside、氫化阿魏酸、對羥基苯乙醇松果菊苷、異毛蕊花糖苷等。經過加工炮制苯乙醇苷類成分易水解，故多存在于生地黃中，熟地中含量較少。如毛蕊花糖苷在地黃中的平均含量依次為鮮地黃＞生地黃＞熟地黃。

1.3  糖類化合物

地黃中的糖類成分占地黃較大比例，分為單糖、寡糖（低聚糖）和多糖。各種糖類成分在鮮地黃、生地黃和熟地黃中含量亦不相同，多糖含量^[11]：鮮地黃（90.2～98.6 mg/g）＞熟地黃（65.9 mg/g）＞生地黃（31.3～50.5 mg/g）。鮮地黃及生地黃中含量最高的寡糖為水蘇糖^[12]，而炮制后熟地黃中水蘇糖含量明顯降低。因生地蒸制過程中水蘇糖以脫果糖為主，生成甘露三糖，故熟地黃中的寡糖以甘露三糖為主。據報道^[13]，棉子糖和蔗糖、毛蕊花糖炮制后含量降低，蜜二糖、甘露三糖、果糖和葡萄糖含量增加。

1.4  呋喃醛衍生物

呋喃醛衍生物在炮制后含量明顯上升，5-羥甲基糠醛（5-HMF）在地黃中的平均含量依次為熟地黃＞生地黃＞鮮地黃^[12]。研究發現其他呋喃醛衍生物5-(α-D-glucopyranosyl)-2-furancarboxaldehyde（5- GMF）、5-(α-D-glucopyranosyl-(1→6)-α-D-glucopy- ranosyloxymethyl)-2-furancarboxaldehyde（5-GGMF）僅在熟地黃中檢測到，生地黃中檢測不到，被認為是快速區分生、熟地黃的標志物^[6]。

1.5  微量元素

生藥炮制是一個微量元素的轉移過程^[14]，一般認為，離子交換態和碳酸鹽結合態的微量元素易溶出，易被生物體吸收利用；而氧化物結合態、有機結合態和殘渣態的微量元素比較穩定，難以被生物利用^[15]。生地黃中微量元素含量順序為Cr＞Fe＞Al＞Cu＞Zn＞Mn＞Sr＞Co＞Pb^[12]。熟地黃中微量元素含量順序為Fe＞Al＞Cu＞Zn＞Mn＞Sr＞Cr＞Co＞Pb。生地黃炮制成熟地黃后^[16-17]，Fe、Mn、Cu、Zn元素的含量都有所增加。加酒與不加酒炮制的熟地黃，微量元素含量順序基本一致。熟地黃中Sr、Mn的溶出率略降低，而Cu的溶出率有所增高，水燉熟地黃較酒燉熟地黃中Zn、Al、Fe的溶出率稍高。

加工炮制過程可致地黃中多種化學成分發生質和量的改變，主要集中在環烯醚萜及其苷類、苯乙醇苷類、糖類、呋喃醛衍生物、微量元素等物質。這些化學成分的變化是導致熟地黃藥性改變的物質基礎。

2  熟地黃活性成分藥理作用

地黃經炮制后其性由寒轉溫，其味由苦轉甘，其功效由清轉補，以滋陰補血、益精填髓為主。近年來，相關學者在熟地黃活性成分的藥理作用方面做了大量的研究，為進一步明確熟地黃的藥效物質奠定了基礎，通過總結分析近年文獻，對熟地黃炮制后變化較大的活性成分的藥理作用進行綜述。

2.1  對血液系統的影響

^[22-23]。研究發現水蘇糖和甘露三糖^[24-25]能顯著促進骨髓細胞的增殖，具有補血活性，還有降血糖、降血壓、調血脂的作用。果糖也表現出較好的造血作用^[26]。5-HMF對鐮狀細胞貧血癥和改善血液流變學方面具有一定的療效^[27-28]。熟地黃中Fe元素含量較高，可能與其補血功效有關。

2.2  對免疫系統的影響

2.3  對中樞神經系統的影響

梓醇、毛蕊花糖苷、松果菊苷^[33-36]都被證實具有良好的神經保護作用。熟地黃多糖能夠延緩異煙肼致驚厥的發作潛伏期，減少動物死亡數，提示熟地黃多糖對中樞神經系統具有抑制作用^[37]。熟地黃有效成分甘露三糖可保護大鼠海馬神經細胞免遭高濃度皮質酮的損傷，通過調節學習記憶^[38][2]。5-HMF可阻斷東莨菪堿誘導的大鼠學習缺陷并增強認知功能；保護大鼠海馬神經細胞免遭高濃度皮質酮的損傷，通過調節學習記憶信號轉導途徑中的重要蛋白P-synapsin I的表達，在延緩學習記憶功能退化方面發揮作用^[39-40]。

2.4  肝、腎保護作用

梓醇^[41-42]、毛蕊花糖苷^[43]有保護腎臟的功能，地黃苷C、桃葉珊瑚苷、野菰酸、紅景天苷均有保肝活性。甘露三糖有抗肝損傷活性^[2]。5-HMF可以通過調節蛋白激酶R樣內質網激酶-真核翻譯起始因子2α（PERK-eIF2α）信號通路保護半乳糖（GalN）/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）損傷的肝細胞免受內質網應激誘導的細胞凋亡，這表明5-HMF可能是治療肝病藥物的候選者，可顯著改善酒精誘導的肝細胞凋亡和脂肪變性^[44-45]。

2.5  其他作用

梓醇有抗胃癌、抗氧化損傷作用^[46-47]，毛蕊花糖苷具有保護卵巢功能的作用^[48]。熟地黃多糖能促進腫瘤細胞的凋亡，并有很好的抗氧化作用^[49]。有研究證明，水蘇糖、甘露三糖和棉子糖對喉癌細胞和肺癌細胞的生長均顯示出一定的抑制作用，其中水蘇糖和甘露三糖的作用較強^[2]。果糖等低聚糖還有潤腸通便的作用^[50]。5-HMF能夠緩解氧化損傷所導致的紅細胞溶血，具有抗氧化活性；還可誘導黑色素瘤A375細胞凋亡，在癌癥化學預防中具有潛在的應用價值；可抑制大鼠腦缺血再灌注損傷；還是脂肪生成強有力的抑制劑和成骨細胞生成的增強劑，其可能是熟地黃發揮抗骨質疏松作用的成分之一^[51-54]。

綜上所述，熟地黃活性成分對血液、免疫、中樞神經系統均顯示出藥理作用，并有肝、腎保護活性等，由于中藥多成分、多靶點、協同作用的特點，炮制后其藥理作用的變化尚不能確定具體是哪些成分的增減所導致的，筆者推測可能是由于炮制后成分群比例發生變化造成其藥理作用產生變化。綜合熟地黃24種主要活性成分的現代藥理研究，依據文獻方法^[55]，采用Cytoscape軟件構建基于主要藥效作用的熟地黃化學物質基礎網絡（圖1）。

3  不同炮制程度熟地黃的質-效評價

3.1  熟地黃炮制過程中化學成分的動態變化

生地黃苦寒清熱，炮制成熟地黃后則變成甘溫滋補。對其炮制過程中化學成分的動態變化的研究有利于監測炮制過程、確定九蒸九曬的炮制終點及對不同炮制程度熟地黃的質量進行動態監測與評價。

3.1.1  利用紅外光譜（FTIR）和正交試驗法對炮制終點的確定  樊克鋒等^[56]利用FTIR對酒燉熟地黃進行炮制過程和炮制終點的評價分析。結果表明15 h時各項指標趨于穩定、特征化。（1）性狀變化：顏色完全變黑；（2）譜圖特征：雙強峰（1057、1 026 cm^?1）、階梯組峰（817、797、777 cm^?1）、777特征峰及二階導數譜峰（819、800、778 cm^?1）等特征化穩定；（3）量化指標：相關峰面積比值持續降低，在15 h時拐點明顯且趨于穩定。張靜等^[57]采用L₉ (3⁴) 正交試驗設計，以5-HMF、毛蕊花糖苷、還原性糖、水浸出物含量及性狀評分為指標篩選熟地黃的炮制工藝。結果表明最優炮制工藝條件為加黃酒量40%，反復9次蒸制、每次蒸制6 h，70 ℃鼓風干燥。

3.1.2  利用高效液相色譜（HPLC）法對炮制過程中物質變化的動態監測  孟祥龍等^[5]基于HPLC探討炮制輔料黃酒對九蒸九曬得到的熟地黃的化學成分動態變化的影響。結果顯示，隨蒸曬次數的增加，清蒸法與酒燉法制得的熟地黃中梓醇、益母草苷、毛蕊花糖苷、水蘇糖、蔗糖、棉子糖均減少；5-HMF、果糖、葡萄糖、甘露三糖均增加。在古法熟地黃九蒸九曬的炮制過程中，炮制輔料黃酒對炮制品的質量存在顯著影響，且清蒸法與酒蒸法均在第3、4、6次蒸曬所得熟地黃的相關物質的量呈現出較大的波動性。

鐘戀等^[58-59]應用統計質量法分析電子舌的傳感器響應值，結合HPLC法發現地黃蒸制法九蒸九曬時隨著炮制程度加深，蒸曬4次后梓醇和毛蕊花糖苷含量明顯下降。而5-HMF在蒸曬第2～9次過程中含量明顯增加。地黃苷A、D在整個炮制過程中含量逐漸減少。葡萄糖在第1次蒸曬時含量就明顯增加，最后1次蒸曬含量有下降趨勢。果糖在蒸曬第4次時含量增加明顯，蒸制6～9次時含量有明顯下降趨勢。相關性分析表明地黃炮制過程中顏色變化與梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF、地黃苷A、地黃苷D均有顯著的相關性。“氣味特征”變化與梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF、地黃苷A、地黃苷D、葡萄糖均有顯著的相關性。“味覺特征”變化與梓醇、5-HMF、地黃苷A、地黃苷D均有顯著的相關性。結合“性狀”及內在成分聚類分析結果表明，地黃清蒸炮制過程中蒸曬5次為其炮制性狀達到火候標準的“拐點”。

3.1.3  利用代謝組學技術對炮制過程中代謝物和標志物的研究  代謝組學的技術平臺主要有核磁共振技術（NMR）、氣-質聯用（GC-MS）及液-質聯用（LC-MS）等，并結合多元統計等方法，較為符合中藥整體性的特點。

Liu等^[60]采用LC-MS對生地黃和酒燉制熟地黃中目標糖進行定量分析。結果表明水蘇糖和蔗糖可能是區分生地黃和熟地黃的合理標記。Chang等^[61-62]用GC-MS聯用技術、主成分分析（PCA）統計學方法，對地黃“九蒸九曬”過程的1、5、9次蒸曬過程和生地黃的代謝物質進行了分析。結果表明隨著蒸制次數的增多，梓醇和水蘇糖的量逐漸減少。PCA分析結果表明5個蒸曬循環后，結果趨于穩定，差異變小。經過¹H-NMR、傅里葉紅外-質譜聯用（FT-MS）、多元統計分析結果表明，梓醇、棉子糖和水蘇糖含量在炮制過程中逐漸下降，而單糖（包括半乳糖和葡萄糖）在炮制后含量逐漸升高，代謝物的譜圖隨加工周期的不同而逐漸變化。差異在第5個處理周期后變小。Zhou等^[7,13]采用基于UPLC-PDA-QTOF-MS/MS的非靶標中藥次生代謝物組學及基于整合HPLC (C₁₈)-UV、HPLC (NH₂)-ELSD和HPGPC-ELSD多維色譜的靶標中藥糖組學方法，從整體上探尋“九蒸九制”對地黃次生代謝物組和糖組的變化規律。9次蒸制后，密力特苷的含量降低，梓醇和桃葉珊瑚苷5次蒸制后幾乎檢測不到。蒸制過程中苯乙醇苷類化合物含量呈波動性變化。在地黃蒸制過程中，5-HMF含量先大幅上升后略有下降。前4次蒸制，總寡糖含量呈下降趨勢，隨后趨于穩定。水蘇糖、棉子糖和蔗糖第1次蒸制后，含量急劇下降，5次蒸制后，幾乎檢測不到，而蜜二糖和甘露三糖急劇增加，隨著蒸制時間的延長含量趨于平穩，果糖和葡萄糖含量也有所增加。6次蒸制后，熟地黃整體品質趨于穩定和均一。在此基礎上從生地黃及蒸曬6次和9次的熟地黃的化學物質組中挖掘出14個化學標志物，分別為苷類（地黃苷A、B、D和毛蕊花糖苷）、呋喃醛衍生物（5-HMF及其單糖苷和二糖苷）、單糖（果糖、葡萄糖）、寡糖（蜜二糖、蔗糖、甘露三糖、棉子糖及水蘇糖）和多糖等成分。

3.2  不同炮制程度熟地黃的藥效和機制研究

隨著代謝組學的發展，中藥整體質/效評價方法有了新的進展。中藥效應代謝組學可表征內源性代謝產物組及其在中藥干預下的變化，以評價中藥的整體生物學效應^[63]。

有研究^[64]整合效應代謝組學和經典藥效指標，從內源代謝干預層面闡明不同炮制次數對熟地黃藥效的影響。用環磷酰胺和乙酰苯肼誘導血虛大鼠模型，比較在血虛狀態下，模型鼠分別灌服生地黃（RRR0）、蒸曬6次的地黃（PRR6）、蒸曬9次的地黃（PRR9）水煎液后的藥效差異，結果表明三者補血強度趨勢為PRR6＞PRR9＞RRR0。PRR9和RRR0能顯著回調的生物標志物（P＜0.05）主要涉及戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化（pentose andglucuronate interconversions）和鞘脂代謝（sphingolipid metabolism）通路，而PRR6除上述通路外，還涉及乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）通路。而在用左旋甲狀腺素鈉誘導的腎陰虛大鼠模型中，三者滋陰強度趨勢為PRR9＞PRR6＞RRR0。PRR6能顯著回調的生物標志物（P＜0.05）主要涉及鞘脂代謝通路，RRR0主要涉及戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化通路，而PRR9除涉及上述通路外，還包括色氨酸代謝（tryptophanmetabolism）通路。效應代謝組學分析結果表明，蒸曬9次的熟地黃滋陰效果較好，而6次蒸曬后的熟地黃補血效果較好，并找到了其可能涉及的代謝通路，但相關的研究還較少，關于不同炮制程度熟地黃的其他藥效研究未見報道。

借助紅外、液相、核磁、質譜等檢測手段和代謝組學策略對熟地黃的炮制過程進行動態監測，熟地黃中的化學成分在蒸制5次或6次達到拐點，后趨于穩定，效應代謝組學結果表明，9次蒸曬的熟地黃滋陰效果較好，6次蒸曬后的熟地黃補血效果較好，為臨床上針對不同用藥目的選擇不同炮制程度的熟地黃提供了依據。

4  結語與展望

^[65]。常見的復方有六味地黃丸、龜齡集、定坤丹等。如熟地黃常與當歸配伍以更好地發揮其滋陰補血的功效，熟地黃與山茱萸配伍能更好發揮其保護肝腎的功能，熟地黃與人參配伍，益氣補血養陰，氣血雙補，陰陽兼顧。臨床上，中藥大都以組方發揮療效，把握熟地黃常見藥對的一般配伍規律，有利于更好地發揮熟地黃的功效，進一步闡明龜齡集^[66]等中藥組方的內涵。但對于不同炮制程度的熟地黃對于藥對、組方的藥效影響研究還較少，如龜齡集等古方為保證優良藥效大都采用古法九蒸九曬，這是對古法炮制工藝的傳承，但其科學內涵亟待闡明，可通過建立動物模型，給予含不同炮制次數熟地黃的龜齡集復方，結合效應代謝組學，對不同炮制程度的熟地黃進行整體、全面的質/效評價，進而揭示炮制內涵，確定在組方中熟地黃的炮制終點，優化炮制工藝。