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文章來源于： sci666 臨床工作忙，搞科研沒時(shí)間？有沒有那種把錢丟進(jìn)去出來一篇文章的研究？單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序了解一下。單細(xì)胞測序有許多公司可以做，極大的節(jié)約了臨床醫(yī)生的寶貴時(shí)間和精力。但是對單細(xì)胞測序一無所知，要怎么開展科研工作呢？今天小編帶家解開單細(xì)胞測序的面紗。 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序定義 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single cell RNA Seq，scRNA-seq）是指對于單個(gè)細(xì)胞水平上將mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序的技術(shù)。那為什么單細(xì)胞測序技術(shù)更精確呢？之所以開發(fā)單細(xì)胞測序技術(shù)，是為了避免單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)被大群體的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)所覆蓋。 比如我有三個(gè)樣本，陽性表達(dá)都不相同，但是由于群體數(shù)據(jù)的覆蓋，所有的結(jié)果都被平均化，所以即使陽性不同的三個(gè)樣本，最后得到的結(jié)果也大致相同。而單細(xì)胞測序則可以將每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平顯現(xiàn)出來，通過數(shù)據(jù)分析可以將每個(gè)細(xì)胞都分為不同的群體，所以更加精確。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用領(lǐng)域
1.人類細(xì)胞圖譜的構(gòu)建，可以對人體所有細(xì)胞進(jìn)行測序，就可以得到不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并且可以從基因表達(dá)中繪制所有細(xì)胞以及其空間組織方式。 2.腫瘤異質(zhì)性研究，可以研究腫瘤的耐藥性，愈后變化，深入癌癥的發(fā)生，發(fā)展機(jī)理。 3.免疫方向研究，可以研究免疫細(xì)胞的異質(zhì)性，解析不同細(xì)胞亞群對病原體入侵時(shí)的響應(yīng)，嘉定不同的免疫細(xì)胞類型。 4.發(fā)育及分化，可以了解不同組織細(xì)胞的異質(zhì)性，對不同細(xì)胞發(fā)育過程進(jìn)行解析，還可以挖掘潛在的特異性分子及探究分子機(jī)制。 5.干細(xì)胞研究，分析干細(xì)胞異質(zhì)性，探究干細(xì)胞潛在的分子標(biāo)記物，研究干細(xì)胞的發(fā)與分化機(jī)理。 6.胚胎發(fā)育研究。可以根據(jù)不同的細(xì)胞亞群，構(gòu)建細(xì)胞譜系，預(yù)測細(xì)胞分化方向。 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序流程 將適當(dāng)濃度的單細(xì)胞懸液，利用含有Barcode和引物的膠珠與細(xì)胞，酶混合通過雙十字系統(tǒng)包裹在油滴中。流到儲(chǔ)液器中被收集，凝膠珠被溶解釋放Barcode。通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有Barcode的cDNA，并對從DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，純化后進(jìn)行檢驗(yàn)。之后酶切打斷產(chǎn)物，按照二代測序技術(shù)的艱苦程序進(jìn)行文庫的構(gòu)建。構(gòu)建好文庫后就可以送公司進(jìn)行測序啦。 需要注意的是測序所用的細(xì)胞必須是新鮮細(xì)胞懸液，可以來源于組織，血液，或細(xì)胞核。但細(xì)胞活性必須在90%以上。現(xiàn)在有許多公司為了保證樣品的新鮮度，都可以上門進(jìn)行細(xì)胞文庫構(gòu)建工作。 得到測序結(jié)果就可以進(jìn)行生物信息學(xué)的分析啦。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對策敘述里質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，例如有效細(xì)胞數(shù)，各個(gè)細(xì)胞中個(gè)基因的飽和度等。之后就是一些數(shù)據(jù)的可視化過程，也是單細(xì)胞測序最終的結(jié)果。
1、細(xì)胞不同類群的tSNE圖 利用tSNE圖將不同類型的細(xì)胞分成不同的細(xì)胞群體，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，不同的顏色表示不同的類別。 2、細(xì)胞亞群基因表達(dá)熱圖 對于不同的細(xì)胞亞群每個(gè)細(xì)胞都會(huì)由特意表達(dá)的基因，基因在不同的細(xì)胞中表達(dá)量也不盡相同，顏色越黃表示表達(dá)量越高，顏色越紫表達(dá)量越低。 3、已知標(biāo)記基因表達(dá)分布圖 利用已知在特定類型細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記基因，通過分析標(biāo)記基因在各個(gè)細(xì)胞亞群中的表達(dá)分布可以鑒定細(xì)胞亞群屬于哪一類細(xì)胞，同時(shí)也可以驗(yàn)證細(xì)胞亞群分類結(jié)果是否準(zhǔn)確合理。 4、已知標(biāo)記基因在細(xì)胞亞群中的小提琴圖 小提親圖可以將已知的標(biāo)記基因在不同細(xì)胞間的表達(dá)情況更明顯的展示出來，可以更加直觀的看到在哪種細(xì)胞中高表達(dá)，在那種細(xì)胞中低表達(dá)。X軸為各個(gè)細(xì)胞亞群，Y軸為標(biāo)記基因的表達(dá)量豐度。 5、基因表達(dá)模式圖 與提琴圖類似可以直觀地看出基因在不同細(xì)胞間表達(dá)情況的變化。 6、細(xì)胞軌跡分析圖 根據(jù)不同組織細(xì)胞的基因表達(dá)模式，模擬出細(xì)胞分化的軌跡，可以看到不同細(xì)胞的發(fā)育前后關(guān)系。在臨床中，單細(xì)胞測序存在著巨大的潛能，對于腫瘤，生殖，血液，神經(jīng)，免疫，干細(xì)胞領(lǐng)域都有許多突破。臨床醫(yī)生可以根據(jù)自己手中的樣本資源與需求進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。 |
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