  實驗原理 將細胞小室（Transwell小室）放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上室內盛裝上層培養液，下室內盛裝下層培養液，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，從而可以研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。    耐思細胞小室（transwell） 應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。當然不同細胞其體積不同，具體選擇時要考慮到細胞大小。 所應有的常見實驗 共培養體系： 小于3.0um孔徑條件下，細胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細胞運動能力，不需要細胞穿過聚碳酸酯膜，則應選擇3.0μm以下孔徑。常用0.4、3.0μm。我們實驗室用的是0.4μm。 將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的影響。 趨化性實驗 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。 ①細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產生的物質對細胞A的趨化作用。 ②趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對細胞的趨化作用。 腫瘤細胞遷移實驗 常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。 腫瘤細胞侵襲實驗 常用8.0、12.0μm膜，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。 上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側鋪上一層基質膠，用以模仿體內細胞外基質，細胞欲進入下室，先要分泌基質金屬蛋白酶（MMPs）將基質膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。 侵襲實驗操作 實驗用品 細胞小室：多種廠家可提供，這些廠家提供的小室，有的已鋪好基質膠，買來就可以用，很方便，但也比較貴。 上層培養液：上層培養液采用無血清培養基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2% BSA。 細胞：值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用于Transwell侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP-2的表達。如果不清楚細胞MMPs的表達情況，就盲目進行Transwell侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費，一次Transwell侵襲實驗花錢少則數百，多則數千，并不是筆小數目，還是小心為妙。 另外，為了讓實驗結果更明顯，可先撤血清讓細胞饑餓12－24h，再進行實驗。 基質膠：常用的是人工重構基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原， 如果購買的小室是已經鋪好基質膠的，那么Matrigel就不需要購買了。 下層培養液：下層常用含5%－10% FBS的培養基，具體濃度根據細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰友將纖維粘連蛋白加入下層培養液作為趨化因子，但個人認為，FBS仍是最合適的。 細胞培養板：常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。細胞培養板沒什么特殊要求，普通的細胞培養板就可以。但要注意，細胞培養板應當與購買的Transwell小室相配套。  24孔細胞小室  12孔細胞小室  6孔細胞小室 此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。如果培養時間很長（>24h），細胞還是會掉到下室里面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。 實驗步驟 無基質膠Transwell小室制備 ① 包被基底膜： 用50mg/L Matrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。 ② 水化基底膜： 吸出培養板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養液，37℃，30min。 另有方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。 制備細胞懸液 ① 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 ② 消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至1－10×105，個人認為不要超過5×105。 具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。個人經驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最后用計數法統計結果的話將難以計數；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內還要有一定量的細胞存在。 對照組和處理盡量不要分開計數，因為細胞數目的差異會嚴重影響實驗結果。如果需要對細胞預處理而不得不分開計數，那么計數一定要多重復幾次，力求準確，盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。 接種細胞 ①取細胞懸液100－200μl加入小室，不同公司的、不同大小的小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200μl。 ② 24孔板下室一般加入500μl含FBS或趨化因子的培養基，不同的培養板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養液和小室間常會有氣泡產生，一旦產生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養板。 ③ 培養細胞：常規培養12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。 另外，我看到細胞在小室內的形態不是正常培養貼壁的形態，而是圓形的，仍是懸浮時的形態，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正常現象。 在培養過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產生，這是正常現象，可不予處理，但我遇到過培養一段時間后，膜下出現了大氣泡，幸虧及時發現，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞后1－2h把培養板從培養箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產生。 結果統計 檢測穿過的細胞數有兩種方法： 直接計數法 1、“貼壁”細胞計數 這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側而不會掉到下室里面去。可以通過給細胞染色，可在鏡下計數細胞 ① 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞； ② 染色：常用的染色方法有結晶紫染色、臺靡藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。 ③ 細胞計數：使用正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側附著的細胞。也有不少人用手術刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。 取若干個視野計數細胞個數。一般采用3-5個視野，也有人用10個，都是隨機選取。 間接計數法 由于某些細胞自身的原因或某些膜的關系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。 間接計數法主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數獲得準確的細胞數所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。 1、MTT法 ① 用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞； ② 24孔板中加入500μl含0.5mg/ml MTT的完全培養基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養基中，37℃ 4h后取出。 ③ 24孔板中加入500μl DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲湃充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上測OD值。 2、熒光試劑檢測 這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細胞，再將細胞裂解，檢測熒光值。Chemicon的ECM554即屬于這類。 3、結晶紫檢測 上文已說過，這里不再贅述，原理與MTT法也是類似的。但結晶紫染色還有個優點，就是染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色。 - end - |
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