 新抗體做WB，總在目的條帶附近出現(xiàn)非特異性條帶，百思不得其解？開門見山，先長(zhǎng)按識(shí)別二維碼來測(cè)一測(cè)原因，CST技術(shù)給您詳細(xì)剖析解決方案： 有童鞋看到雜帶，只懷疑抗體的原因，測(cè)完之后，您還認(rèn)為—— “非特異性”條帶一定是抗體的鍋嗎？ 當(dāng)然不是。對(duì)于CST的抗體，都是內(nèi)部研發(fā)生產(chǎn)并且經(jīng)過多重交叉驗(yàn)證之后才提供給客戶的，CST盡全力保證出廠的抗體都具有高靈敏度、高特異性、高度可重復(fù)性。如果您用CST抗體出現(xiàn)多條非特異性條帶，除了考慮一抗的因素，您還需要考慮以下幾個(gè)因素： . 1 . 原因：細(xì)胞系傳代次數(shù)過多，蛋白表達(dá)譜發(fā)生變化。 建議：使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細(xì)胞系（不超過15代）進(jìn)行樣品制備。 . 2 . 原因：與細(xì)胞系裂解物相比，原代細(xì)胞或組織提取物會(huì)傾向于有較高的背景和降解條帶。 建議：1. 用新鮮提取的，經(jīng)過超聲處理的澄清的組織提取物能降低背景。 . 3 . 原因：蛋白被降解。 建議：1. 提取液確保含有蛋白酶抑制劑，并超聲； 2. 蛋白樣品提取后分裝－20℃或－80℃短期保存，避免反復(fù)凍融，有條件盡量用新鮮提取的蛋白。 . 4 . 原因：蛋白本身有很多修飾。 建議：查閱文獻(xiàn)，確定目的蛋白是否存在多種修飾，泛素化、糖基化等修飾會(huì)讓蛋白的條帶發(fā)生較大的偏移。 . 5 . 原因：所檢測(cè)蛋白存在多種剪接體，導(dǎo)致分子量大小不同。 建議：查閱文獻(xiàn)或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長(zhǎng)度不同的編碼mRNA。 . 6 . 原因：蛋白存在二聚體或多聚體。 建議：SDS loading buffer中現(xiàn)用現(xiàn)加β－巰基乙醇或DTT。 . 7 . 原因：樣本存在外源轉(zhuǎn)入蛋白。 建議：檢查所用樣本是否有過被外源進(jìn)去帶有標(biāo)簽的靶標(biāo)蛋白。如有，更換細(xì)胞系樣本。 . 8 . 原因：上樣量過多。 建議：根據(jù)靶標(biāo)表達(dá)情況，梯度上樣跑膠后選擇合適的上樣量，通常20-50μg即可。 . 9 . 原因：實(shí)驗(yàn)操作與CST推薦的步驟有較大出入。 建議：1. CST推薦封閉液用5%脫脂奶粉／TBST，室溫1h； 我們通過兩個(gè)案例來具體分析下：  （來自客戶技術(shù)咨詢案例） 實(shí)驗(yàn)條件：檢測(cè)靶標(biāo)Phospho-Akt (Ser473)；使用抗體：CST #4060S Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP? Rabbit mAb；細(xì)胞系：MCF7。 問題：出現(xiàn)非特異性條帶。Phospho-Akt (Ser473)（綠色）檢測(cè)出2條帶，一條在預(yù)測(cè)分子量60kd左右，另外一條稍大，兩條bands強(qiáng)度差不多。紅色熒光為內(nèi)參蛋白β-Tubulin。 圖1 引用自客戶技術(shù)咨詢案例 解決方案：建議客戶復(fù)蘇傳代較少的細(xì)胞，重新刺激、裂解之后，即得到了單一的條帶。 問題分析：AKT激酶由3個(gè)分子量非常相近的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成：AKT1, AKT2和AKT3。Phospho-Akt (Ser473)正常情況下應(yīng)該只有1條帶，但在某些特定條件下，AKT還可以發(fā)生糖基化、泛素化等修飾，從而造成蛋白大小發(fā)生改變。在這個(gè)案例的溝通中，我們發(fā)現(xiàn)客戶之前使用的細(xì)胞系傳代超過了25代，所以重新用較少代數(shù)的健康細(xì)胞，用了同樣的抗體，最終得到了單一條帶。 國(guó)內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞傳代并不嚴(yán)格記錄傳代次數(shù)，以至于很多老師使用的細(xì)胞自己也都不知道多少代，所以這些細(xì)胞系里蛋白表達(dá)譜是否發(fā)生變化，甚至這些細(xì)胞系是否有被其他細(xì)胞或支原體污染等問題也不得而知。因此，我們呼吁老師們重視細(xì)胞系的培養(yǎng)，定期排查細(xì)胞污染，控制傳代次數(shù)，只用健康的細(xì)胞，確保實(shí)驗(yàn)可靠。 |
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