CSCO2019甲基化篇 | 如何高效利用FFPE樣本開展DNA甲基化研究

DNA甲基化是表觀遺傳學研究的重要組成，DNA甲基化修飾參與胚胎發育、基因印記、X染色體失活等過程，對基因表達調控具有重要作用。異常的DNA甲基化可能導致疾病、腫瘤的發生。目前DNA甲基化越來越受到生命科學研究領域的關注，逐漸成為醫學領域的一個重要研究方向和熱點。

常用的DNA甲基化研究方法包括850K 甲基化芯片，WGBS，甲基化捕獲測序，MeDIP，RRBS等。其中Illumina的甲基化芯片Infinium Methylation EPIC BeadChip（850K 芯片）具有單堿基識別、低起始量、重復性高、全基因組覆蓋的特點，是一款性能優越且經濟可靠DNA甲基化研究技術。

FFPE樣本由病理科例行組織活檢、免疫組化病理學檢查需要而制備，是臨床樣本最常見的保存形式。由于FFPE樣本能追溯到疾病診斷、病變、發展、預后、療效等重要臨床信息，是基礎科研與臨床實驗的珍貴樣本。然而FFPE樣本本身易降解、交聯，在進行高通量檢測時難以獲得高質量的數據，導致科研人員不敢使用，這實際上是缺乏有效的解決方案。如果通過各項優化手段和質控策略，確保高通量的數據，那么FFPE樣本必將成為火熱的研究材料，為樣本收集、臨床隨訪信息收集、實驗設計節省出寶貴的時間。

常見的FFPE樣本包括切片、蠟卷和蠟塊。切片需要量為6~10μm切片10~15片，切片大小2×2cm為宜。對于腫瘤組織，建議腫瘤細胞含量>80%，可通過連續切片，選取首尾兩張進行病理鑒定以確定腫瘤組織含量，中間的白片用于DNA甲基化或WES的研究。

通常的，5年以內的FFPE樣本DNA質檢結果較好，5~10年或者更長的樣本的DNA質量下降明顯。同時，不同單位的制備方法存在差異，保存時間、溫濕度不盡相同，DNA質檢也會有所差異。

圖1 FFPE樣本類型

FFPE樣本DNA抽提試劑方法需有效去除樣本中的石蠟，逆轉福爾馬林導致的交聯狀態，同時過濾掉樣本中的雜質和污染物。不僅如此，抽提實驗中仍需要加入RNA酶，以確保獲得總量高，純度高的DNA樣本。

DNA樣本的260/280需控制在1.8上下，如果比值過高，則表明有降解的RNA污染，可通過電泳圖確認。

圖2 FFPE樣本中解決RNA污染問題

Bisulfite轉化一直都是DNA甲基化檢測的核心步驟。中科普瑞經過研發測試，逐漸形成了一套針對DNA降解程度不同的Bisulfite轉化體系：快速轉化體系、過夜轉化體系、溫和轉化體系。

由于FFPE樣本不同程度的降解，推薦使用過夜轉化體系和溫和轉化體系。下圖為相同樣本對應不同BS轉化體系產物的電泳圖。可見，溫和轉化體系更容易保留大片段樣本，能夠盡可能降低對DNA片段損壞程度。對于DNA降解程度低的樣本，推薦使用過夜轉化體系完成，而降解程度高的樣本，考慮使用溫和轉化體系。

圖3 中科普瑞三種Bisulfite轉化體系結果展示

FFPE樣本的降解、交聯和擴增受抑制等現象會影響DNA甲基化的檢測，Illumina官方推出了一款專業的修復試劑盒（Infinium HD FFPE DNA Restore kit），可有效提高850K芯片的數據質量。圖4介紹了修復試劑盒的修復原理。

圖4  FFPE樣本修復示意圖（圖片源自illumina修復試劑盒視頻）

圖5A可以看到未修復的FFPE樣本與新鮮凍存樣本相關性系數波動極大，說明FFPE樣本的不穩定性。修復后的FFPE樣本與新鮮凍存樣本相關性系數均超過0.9，說明FFPE的修復過程能夠得到更真實而均一的數據。圖5B兩張圖分別展示修復后與新鮮冰凍樣本中相關性最低和最高的結果，相關性均超過0.9。可以看到FFPE修復技術對于樣本真實狀態的還原效果是顯著的。

圖5 文獻報道的FFPE修復數據展示。A. FFPE樣本（FFPE）、FFPE修復樣本（FFPEr）分別與新鮮凍存樣本（FF）的相關性圖（DOI 10.1186/s13148-017-0333-7）。B.穩定的FFPE修復效果（DOI：10.1038/labinvest.2015.53）

樣本質控：通過DNA總量、DNA濃度、OD260/280、電泳圖質控實驗風險。

實驗質控：通過芯片質控探針，質控芯片雜交、延伸、清洗和染色全過程。

數據控制：根據detected P值去掉不可靠位點，同時過濾多重映射等位點，確保數據完整可信。

差異甲基化位點（DMP）分析：在全基因組范圍86W位點中尋找差異甲基化位點。

差異甲基化區域（DMR）分析：腫瘤組織變異程度大，鄰近的多個差異甲基化位點可能形成一個區域，如啟動子區、甲基化島等。

功能注釋：通過DMP、DMR鄰近基因進行富集分析、功能注釋，以解釋潛在的調控作用。

圖6 DMP和DMR結果展示圖

拷貝數變異（CNV）分析：CNV在腫瘤研究中具有重要地位，可利用850K數據中區段信號值變異程度進行CNV分析，發現腫瘤樣本中的拷貝數變異。

表觀功能模塊（Functional Epigenetic Modules，FEM）分析是功能富集的一種，與常規的GO和KEGG富集分析不同，該分析基于蛋白互作網絡，能夠找到潛在的具有重要功能的基因。

圖7 CNV分析和FEM分析結果展示

甲基化顯著波動位點（DVP）分析：種基于組間數據變異程度的分析方法，觀測DNA甲基化β值的“波動性”，發現DMP分析無法找到CpGs。

基于TCGA數據庫的樣本tSNE分析：基于甲基化數據，區分不同腫瘤，同時了解自有數據中組間和組內的樣本相似程度，以及與TCGA數據庫中相同疾病樣本的相似程度。對了解取樣部位是否偏離、轉移灶樣本的溯源有一定的幫助。

圖8 DVP分析和基于TCGA數據庫的tSNE分析

DNA甲基化對貝伐單抗療效的影響（IF=8.063，發表時間：2018年）

原標題：DNA Methylation Signatures Predicting Bevacizumab Efficacy in Metastatic Breast

Cancer.（PMID：29721079）

貝伐單抗與紫杉醇或卡培他濱組合是EMA推薦的HER2陰性的乳腺癌患者的治療方式，但目前缺乏生物標志物預測其治療效果。研究人員從2006年至2012年的212例貝伐單抗治療乳腺癌的FFPE樣本中篩選到116例信息匹配樣本，其中36例為一線治療樣本，并將其分為治療響應組R和未響應組NR。（腫瘤組織樣本足夠，記錄ER表達，隨訪信息完備可用于計算PFS、OS）。

DNA甲基化是表觀調控的重要組成，越來越多的報道證實表觀修飾的變化參與了耐藥性的發展，比如通過影響血管生成基因的表達，反向影響抗血管生成療法。因此，研究人員期望找到表觀層面的預測療效的生物標志物。通過450K芯片分析，一共找到192個顯著差異的CpGs（|Δβ|>0.1,p<0.001），其中48個CpGs與血管生成基因和致癌基因相關。通過靶向測序和驗證集（80例組織）驗證，最終找到9個CpGs（9Genes：WNT2B，MLH1，POLK，NOX4，PKNOX2，TMBIM6，SNRPN，UNC119，GNAS），AUCLOOCV=0.91。隨后研究人員通過邏輯回歸分析和留一發交叉驗證，進一步篩選到3個CpGs的panel（3genes：MLH1，POLK，TMBIM6）用于治療響應預測（驗證集AUC=0.86；PFS logrank p=1.4×10-5；HR=0.29）。

圖9 DNA甲基化生物標志物預測貝伐單抗對乳腺癌治療效果

（上：發現集中9CpGs的無監督聚類；下：驗證集中的ROC曲線、PFS圖和OS圖）

這篇文獻是首次通過DNA甲基化預測貝伐單抗療效的研究。研究樣本為FFPE，結合臨床記錄快速開展實驗并得到療效和預后預測結果。而如果收取新鮮凍存樣本，則收樣、隨訪會花掉大量時間。