EGFR 抑制劑治療結直腸癌的耐藥標志物

摘要

表皮生長因子受體(EGFR)是治療結直腸癌(colorectal cancer, CRC)的一個靶點，然而EGFR抑制劑似乎只對部分CRC病人有作用。EGFR抑制劑的耐藥機制逐漸被認識。KRAS12號外顯子活化突變在EGFR抑制劑的耐藥方面占主導地位，約40%晚期結直腸癌病人發生該基因突變。其他可能的耐藥機制包括配體表達、EGFR拷貝數增加、BRAF基因突變和其他信號通路的激活等。

前言

結直腸癌是美國診出率第四、死亡率第二的癌癥，2102年的新發病例數為143,460例，死亡病例數為51,690例（1）。40-50%的初診結直腸癌病人已經出現轉移，說明全身的系統性治療非常重要（2）。過去的10年中，奧沙利鉑、伊立替康、西妥昔單抗、帕尼單抗、貝伐珠單抗、阿柏西普、瑞戈非尼等化療藥物（3-6）的批準上市，使得晚期結直腸癌患者的中位總生存期幾乎翻倍—從5-FU時代的12個月延長至22個月左右。然而，這些藥物的應用在大大增加了結直腸癌患者治療費的同時，也帶來了一系列的不良反應。這些因素促使基于耐藥機制的生物標志物的研究，以使患者真正從特定治療方案中獲益。KRAS基因突變是對西妥昔單抗（7-9）和帕尼單抗（10-13）耐藥的一個機制，它引領了結直腸癌個體化治療的開始。大約40%的結直腸癌病人存在KRAS基因突變以及對EGFR抑制劑耐藥。而KRAS基因野生型的存在使得病人不能從EGFR抑制劑的治療中獲益。因此，在KRAS野生型的轉移性結直腸癌病人中，尋找那些能夠識別無效以及初始有效，隨后耐藥的其他的耐藥通路和可能的預測標志物顯得尤為重要。

表皮生長因子受體(EGFR)

EGFR已被確定存在于多種人類上皮源性腫瘤，如頭頸部鱗狀細胞癌、結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌和腦腫瘤。EGFR是一種170kDa的糖蛋白，其編碼基因位于7號染色體p12。EGFR是人類表皮酪氨酸激酶受體（Her）家族的成員之一，Her家族包括EGFR (erbB1/Her1)，Her2/neu (erbB2)，Her3 (erbB3)，Her4 (erbB4)。EGFR包括一個胞外配體結合域(I、II、III、IV)，一個跨膜區，一個胞內近膜結構域和胞漿酪氨酸激酶結合域。EGFR結合配體（如EGF、TGFα、雙調蛋白、肝素結合EGF、細胞調節素和上皮調節蛋白）后形成同源或異源二聚體，激活酪氨酸激酶結合域。在羧基終端尾部酪氨酸激酶介導酪氨酸磷酸化位點進行磷酸化。EGFR的活化激活多種復雜的胞內信號傳導通路，而這些信號通路受配體、異源二聚體復合物、磷酸酪氨酸結合蛋白的調節。EGFR激活的兩條主要信號通路是RAS-RAF-MAPK通路和PI3K-PTEN/PTEN/AKT通路（圖1）。PI3K/AKT通路的激活促使蛋白質合成、細胞生長、存活和遷移。而RAS-RAF-MAPK通路則促使細胞周期性生長和增殖（14,15）。

圖1 EGFR生物學。配體（圖中為紅色，epiregulin, amphiregulin）結合于EGFR的細胞外功能區，引起同源或異源性二聚體化，導致細胞漿尾部的酪氨酸殘基（圖中黃色部分）磷酸化。激活的EGFR導致KRAS活化，由此而順序激活癌基因BRAF、MEK（分裂原活化蛋白激酶激酶）和MAPK（分裂原活化蛋白激酶），并導致促生長基因的表達。除了激活KRAS，EGFR還激活PIK3CA，后者依次將PIP2（2-磷酸-磷脂酰肌醇）磷酸化為PIP3（3-磷酸-磷脂酰肌醇）、激活AKT和幾個下游的效應因子，導致蛋白質合成、細胞生長、存活、增值、遷移和血管生成。耐藥機制已經被假說過，部分在該圖中得到顯示，miRNA-143在腫瘤細胞中表達較低，導致對KRAS的抑制減弱，腫瘤增值加快。紅色方塊代表EGFR配體（epiregulin, amphiregulin），紅色線條代表抑制效應。

KRAS

人類KRAS癌基因同系物編碼一種小GTP結合蛋白。細胞表面受體（包括EGFR）被活化后，此蛋白可在GDP和GTP結合狀態的循環中起自我失活信號轉到的作用。KRAS基因可庇護致癌性的突變并產生持續活化的蛋白。鑒于KRAS基因在EGFR信號傳導通路中起關鍵性作用，因此，評估KRAS基因的突變影響并以此研究EGFR抑制劑的耐藥機制是一種很好的方法。在結直腸癌中（包括原發灶和轉移灶，不包括淋巴結），大約35%-45%病人存在KRAS基因12號外顯子突變。多項回顧性研究發現KRAS基因突變型患者對抗EGFR治療耐藥（6,16）。這些研究的總結見表1。兩項重要的EGFR抑制劑單藥對比最佳支持治療的研究顯示KRAS基因突變在EGFR抑制劑耐藥中所起的作用。在第一項研究（NCIC試驗）中，572例化療難治性的晚期結直腸癌患者被隨機分成兩組，分別為西妥昔單抗組和最佳支持治療的三線治療。結果顯示西妥昔單抗可顯著延長OS（HR，0.77；95% CI，0.64-0.92；P=0.005）和PFS （HR，0.68；95% CI，0.57-0.80；P<0.001）（5）。可取得標本的394例進行了亞組分析，結果顯示，KRAS野生型的患者OS（中位9.5月 vs. 4.8月；HR，0.55；95% CI，0.41-0.74；P<0.001）和PFS （中位3.7月 vs. 1.9月；HR，0.40；95% CI，0.30-0.54；P<0.001）明顯延長。相對于最佳支持治療來講，KRAS突變型患者的OS和PFS并未從西妥昔單抗的治療中獲益（27）。另外一項帕尼單抗對比最佳支持治療在化療難治性結直腸癌的隨機對照臨床研究中也得出相似結果。KRAS野生型患者接受帕尼單抗治療的PFS為8周，較最佳支持治療組（7.3周）長（HR，0.54；95% CI，0.44-0.66；P<0.0001）。帕尼單抗組的有效率為10%，而最佳支持治療組為0（P<0.0001）。KRAS突變型患者接受帕尼單抗治療的OS并未較最佳支持治療組延長（HR，1.00；95% CI，0.82 to 1.22）（26）。

在CRYSTAL研究中，1,198例初治的晚期結直腸癌患者被隨機分成兩組，分別接受西妥昔單抗 FOLFIRI或FOLFIRI治療。結果顯示西妥昔單抗 FOLFIRI組的PFS較FOLFIRI組延長（HR，0.85；95% CI，0.72-0.99；P=0.048），而兩組的OS沒有差別（HR，0.93；95% CI，0.81 to 1.07；P=0.31）。亞組分析顯示，KRAS突變型患者（37%）接受西妥昔單抗 FOLFIRI治療后，其OS（HR，1.03）和PFS（HR，1.07；P=0.75）都沒有延長。KRAS野生型患者接受西妥昔單抗 FOLFIRI治療后的PFS為9.9月，FOLFIRI組為8.4月（HR，0.68；95% CI，0.50-0.94；P=0.02）；而兩組的OS分別為23.5月和20.0月（HR，0.84；P=0.0093）；兩組的有效率分別為57.3%和39.7%（P=0.001）。這項研究的結果使西妥昔單抗被批準聯合FOLFIRI一線治療KRAS野生型的轉移性結直腸癌（6,25）。

大約6%的結直腸癌病人存在KRAS基因13號密碼子突變。13號密碼子突變對產生EGFR抑制劑耐藥的影響仍然是有爭論的。有體外實驗顯示KRAS13號密碼子突變較12號密碼子突變有更低的轉化活性，對凋亡和生長能力的耐藥性更低（28）。DeRoock等人研究了應用西妥昔單抗治療的難治性結直腸癌病人的p.G13D突變與有效率及生存期的關系。p.G13D突變者有更長的OS（7.6月vs.5.7月，P=0.005）和PFS（4.0月vs.1.9月，P=0.004）。雖然這些結果提示p.G13D突變的病人對西妥昔單抗治療有效，但其有效率仍然低于KRAS野生型病人。在此研究中，體外實驗和小鼠模型均提示p.G12V突變的結直腸癌細胞對西妥昔單抗不敏感，而p.G13D突變的細胞和KRAS野生型對西妥昔單抗是敏感的（21）。Peeters等在三項帕尼單抗治療晚期結直腸癌的臨床試驗中分析了KRAS基因13號密碼子的突變狀態。結果顯示13號密碼子突變的病人對帕尼單抗治療無效。KRAS基因13號密碼子突變對EGFR抑制劑存在不同的敏感性的原因可能是應用不同的藥物（帕尼單抗和西妥昔單抗），或者是13號密碼子突變與不同化療藥物之間存在不一樣的相互作用。在這方面，由于缺乏前瞻性的臨床試驗，13號密碼子突變對EGFR抑制劑耐藥的影響仍然是有爭論的（29）。

KRAS之外的耐藥機制

大約一半的KRAS基因野生型患者對抗EGFR治療無效，因此，除了KRAS基因突變，還有其他因素影響耐藥性的產生。這些因素包括EGFR配體表達增加、EGFR表達降低、其他信號傳導通路的激活等。

EGFR、上皮調節蛋白和雙調蛋白的表達水平

Baker等分析了原發灶活檢組織的KRAS和EGFR配體基因的表達情況（用同一組病人的轉移灶活檢標本進行了驗證）。結果顯示有43%病人存在KRAS基因突變。KRAS野生型病人對EGFR抑制劑的敏感性與EGFR配體、上皮調節蛋白和雙調蛋白的表達水平呈正相關關系。EGFR配體表達水平高的KRAS野生型病人使用抗EGFR治療有效率高，EGFR配體表達水平低的KRAS野生型病人有效率低，接近KRAS突變型病人。另外，相比上皮調節蛋白（P=0.0002）和雙調蛋白（P=0.0001）表達水平低的病人，EGFR配體表達水平高的KRAS野生型病人有更高的疾病控制率和PFS（30）。在KRAS突變型腫瘤中，并沒有證據證明上皮調節蛋白和雙調蛋白的表達水平與OS和PFS之間存在相關性（31）。在EGFR配體上皮調節蛋白和雙調蛋白mRNA高表達的病人中，西妥昔單抗有更高的抗腫瘤活性。因此，在EGFR配體的低表達可能是抗EGFR治療耐藥的其中一個機制，提示EGFR系統可能并不是控制腫瘤生長或進展的主要因素。

EGFR表達

最初在EGFR抑制劑的應用中，只選擇免疫組化確認EGFR表達陽性的病人入組臨床試驗。這是基于這樣一個概念：如果EGFR不表達，那么EGFR抑制劑就會耐藥。在Ghung等人進行的研究中，16位病人中有4位EGFR表達陰性，但對西妥昔單抗為基礎的治療均有明顯療效（32）。因此，使用免疫組化的方法檢測EGFR的表達情況并不能預測EGFR抑制劑的耐藥情況。

另外，也有研究應用分子生物學的方法檢測EGFR的表達，驗證其是否影響EGFR抑制劑的耐藥。Moroni等人進行了一項研究，對31例使用西妥昔單抗或帕尼單抗治療的轉移性結直腸癌患者進行EGFR基因拷貝數的檢測，其中，有效或穩定的病人占30%，進展的病人占70%。9位治療有效的病人中，有8位病人的EGFR基因拷貝數增加。另一方面，21位治療無效的病人中，只有1位病人的EGFR基因拷貝數增加（P<0.0001）（33）。提示EGFR基因拷貝數可以作為EGFR抑制劑療效預測的指標。EGFR基因拷貝數＜2.5/細胞核或者＜40%細胞提示腫瘤內7號染色體多體性，有更短的PFS（P=0.039）和OS（P=0.015）（34）。Lenz等人用PCR法代替FISH法檢測對西妥昔單抗治療有效病人的EGFR基因拷貝數，并未發現基因拷貝數與有效率及PFS之間有相關性，但與OS之間存在相關性（35）。有回顧性研究用FISH法檢測了85例接受西妥昔單抗治療的難治性結直腸癌患者的EGFR基因拷貝數，發現基因拷貝數高的病人有較高的有效率和較長的PFS，評價的基因拷貝數為2.92（36,37）。在Lievre等人進行的研究中，用顯色原位雜交法(CGH)檢測EGFR基因拷貝數，結果發現基因拷貝數高的病人使用西妥昔單抗治療的有效率高。然而，由于基因拷貝數高的病人數太少，使其結論受到質疑（38）。大規模的調查顯示EGFR基因拷貝數升高的病人占6%，與疾病控制率并無相關性（33）。最近的一項Meta分析顯示EGFR基因拷貝數升高的轉移性結直腸癌病人接受抗EGFR治療后的生存期較長（39）。總的來說，用目前的數據證實EGFR基因拷貝數對于EGFR抑制劑耐藥的作用存在不一致性，這主要是因為存在不同的檢測方法、不確定的閾值以及缺少標準化。由于存在不同的檢測方法（FISH、qPCR或者CGH），使得結果的可比性較差。

BRAF

蘇氨酸蛋白激酶BRAF是KRAS的主要效應器。BRAF突變發生在KRAS的下游通路上，在結直腸癌里的發生率不到10%。不同基因的體細胞突變使病人有不同的生存期：BRAF突變型，8.8月；KRAS突變型，14.4月；KRAS野生型，20.1月（40）。在接受單獨FOLFIRI治療和FOLFIRI聯合西妥昔單抗治療的病人中，KRAS野生型、BRAF V600E突變型的病人預后較差；BRAF突變的患者效果也較差。V600E突變約占6%。在CRYSTAL研究中，對KRAS野生型的腫瘤進行了BRAF突變的檢測，結果顯示BRAF突變狀態與抗EGFR治療的療效相關。BRAF突變是有效率低和生存期短的預測因子。然而，此研究中BRAF突變的病人數很少，還難以肯定BRAF突變是西妥昔單抗的療效預測因子（6）。在其他的研究中發現，BRAF突變是轉移性結直腸癌生存期短的預后因子（41,42）。在NORDIC VII研究中，相對于BRAF野生型來說，BRAF突變型病人的有效率更低、PFS和OS更短（43）。一項回顧性研究分析了113例接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療的病人，探索KRAS和BRAF基因突變狀態與有效率、PFS和OS之間的關系。在KRAS野生型中，BRAF V600E突變占14%。沒有一例BRAF突變型的病人對抗EGFR治療有效，而且PFS和OS更短。BRAF突變在抗EGFR治療中的地位與KRAS突變相似（44）。而且，MSI-H的患者中有50%存在BRAF突變，MSS患者只有12%存在BRAF突變（45-47）。BRAF抑制劑-威羅菲尼(vemurafenib)的療效也是很有限的。有人認為這是因為抑制BRAF后，EGFR被激活更多。而黑色素瘤細胞表面表達低水平的EGFR，可能導致了療效的差異（48-52）。一項體外實驗顯示聯合應用索拉非尼和EGFR抑制劑，可以對BRAF突變的結直腸癌細胞有潛在的抑制作用，而單獨使用則無明顯效果。這些數據表明對于BRAF突變型的腫瘤，可以通過阻斷EGFR通路上的多個位點來恢復西妥昔單抗或帕尼單抗的治療效果。除索拉非尼外，以BRAF (PLX4032)及其下游效應器作為靶點的藥物，如ARRY-162、AZD6244和PD0325901等都在進行與EGFR抗體聯治療合的臨床試驗（53,54）。盡管KRAS和BRAF都是野生型，仍然有41%的患者對EGFR抑制劑無效。因此，研究其他通路對EGFR抑制劑耐藥的影響顯得尤為重要（44）。

PIK3基因

一項評價西妥昔單抗聯合化療治療化療難治性結直腸癌病人的研究的結果顯示，PIK3CA基因20號外顯子突變的病人療效較野生型差；而PIK3CA 9號外顯子突變與療效之間無相關性（40）。另外一項綜述分析了接受EGFR抑制劑治療的轉移性結直腸癌患者的PIK3CA突變狀態與療效的關系，也得出了相似的結果。這些結果提示在KRAS野生型的轉移性結直腸癌患者中，PIK3CA 基因20號外顯子突變狀態是預測EGFR抑制劑耐藥的潛在標志物（55）。由于PIK3CA突變與KRAS突變是共同存在的，因此它可以影響EGFR抑制劑的耐藥性。然而，很難確定它們之間一對一的關系。PIK3CA的熱點突變，尤其是螺旋和激酶結合域的突變，可能產生與KRAS不同的，但具有協同性的耐藥機制（56）。簡而言之，PIK3CA突變對EGFR抑制劑耐藥的影響還是存在爭論的。

一項研究對200例接受西妥昔單抗治療的KRAS野生型的轉移性結直腸癌病人進行了PIK3CA檢測，結果發現PIK3CA突變狀態對療效沒有影響（57）。PIK3CA突變占16.4%。PIK3CA突變偶爾與其他基因的突變共存。單因素分析顯示，影響總生存的預后因子包括：BRAF突變、KRAS基因12號外顯子突變、KRAS野生型中雙調蛋白高表達、所有患者中的上皮調節蛋白高表達。有效的預測因子包括：KRAS野生型中雙調蛋白mRNA高表達、上皮調節蛋白mRNA高表達、肝配蛋白A2受體mRNA低表達。雙調蛋白低表達的KRAS野生型病人接受西妥昔單抗治療后的療效差，其生存期與KRAS突變型的患者相似；KRAS基因13號密碼子突變或其他非12號密碼子突變病人的中位生存期與KRAS野生型相似。此結果與之前認為KRAS基因12號密碼子突變的生存期最差的觀點不一致（58）。根據靶向治療的研究結果，KRAS突變對PI3K通路的抑制劑耐藥（59）。KRAS突變提示對PI3K抑制劑（PX-866）耐藥（60）。這限制了單純的PI3K抑制劑在同時存在KRAS和PIK3CA突變的結腸癌中的應用（61）。

PTEN

PIK3通路中一些基因的活化（如PIK3CA和AKT1），或者是PTEN基因的缺失，可以強化PI3K信號傳導（62-64）。具有微衛星不穩定性的結直腸癌患者中，大約有18%存在PTEN基因突變，提示PTEN基因的錯配修復缺失可能是一個潛在的治療靶點（65,66）。進一步的研究提示在微衛星不穩定性高的病人中，PTEN啟動子高甲基化的比率高于微衛星不穩定性低的病人（19.1% vs. 2.2%；P=0.002）（67）。一項研究對KRAS、BRAF和PTEN進行了聯合分析，結果顯示39%患者的KRAS、BRAF和PTEN均為野生型，這部分難治性患者接受西妥昔單抗治療的有效率可高達45%。而PTEN突變的患者對西妥昔單抗耐藥（68）。

MAPK

KRAS-MAPK-PI3KCA通路的交叉對腫瘤的發生有非常復雜的影響。KRAS的突變率決定于2號外顯子，其中12和13號密碼子是最常見的突變（69）。MAPK信號通路中的基因變異可影響結直腸癌的發生，而環境和生活方式（如阿司匹林或非甾體類消炎藥的使用、吸煙、雌激素水平和體重指數）可影響其基因變異（70）。在KRAS肺癌模型中，使用PI3K/mTOR抑制劑（NVP-BEZ235）和MEK抑制劑（ARRY-142886）來同時抑制PI3K和MAPK通路使腫瘤顯著縮小（59）。

MEK

MEK是KRAS下游的另外一個靶點。MEK激活胞外的信號調節激酶（ERK-1和ERK-2），這些激酶與控制細胞周期從G期到S期的因子的磷酸化起應答反應。另外一種細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）的活化可以通過胞漿膜或者下游組件使EGFR產生旁路，從而獲得對EGFR抑制劑的耐藥性。通過培養西妥昔單抗耐藥細胞株，Yonesaka等第一次鑒定出應用西妥昔單抗后低抑制ERK1/2磷酸化的多克隆。進一步的研究發現這些克隆使ERBB2擴增增加，包括總的和磷酸化的ERBB2水平。隨后，在耐藥細胞株中抑制ERBB2后可重新獲得對西妥昔單抗的敏感性。這肯定了ERBB2在耐藥機制中的重要性。ERBB2擴增被認為是對西妥昔單抗耐藥的一個機制，這種獲得性耐藥是通過一種結合ERBB3和ERBB4的配體-調蛋白來介導的。這使得下游通路的靶點活化，而這種配體的作用仍有待進一步研究（71）。近來的分子分析認為，KRAS的分子改變導致了EGFR抑制劑獲得性耐藥的產生。西妥昔單抗治療的突變KRAS等位基因的檢測比疾病進展的影像學證據早10個月。有證據表明早期聯合使用EGFR抑制劑和MEK抑制劑可以延緩或逆轉耐藥性的產生（72）。

IGF1

胰島素樣生長因子受體-1（IGF-1R）包括胰島素受體和胰島素受體相關受體在內的跨膜酪氨酸激酶家族的一員。在不同的腫瘤中，IGF-1R信號通路是非常重要的，它通過MAPK和PI3K參與了IGF信號的轉導。臨床前研究證實聯合使用IGF1-R和EGFR抑制劑可對結直腸癌細胞的生長產生協同抑制作用（73）。有證據表明，IGF-1R和EGFR之間的相互作用，對于EGFR的促有絲分裂和轉化活性是至關重要的。更具體地說，IGF-1下游信號的級聯反應被認為可以誘發EGFR非依賴性的PIK3CA和AKT活性，這從另外一個方面解釋了為什么有些KRAS野生型患者對抗EGFR的單克隆抗體治療無效（74）。Bohula等人的研究支持了這一點。他們的實驗證明了IGF-1和IGF-2可以產生蛋白激素，與IGF-1R起相互作用，調節細胞的生長、分化和存活。IGF-1R激活RAS/ERK和PI3K/AKT相關的信號轉導通路，起到加速增殖、減少凋亡的作用（75）。一項在西妥昔單抗或帕尼單抗治療失敗的病人中使用抗IGF-1R單克隆抗體（IMC-A12）單藥或聯合西妥昔單抗的II期臨床試驗正在進行中。在23例單純應用IMC-A12的患者中均未看到抗腫瘤活性。而在21例聯合使用IMC-A12和西妥昔單抗的患者中，有1例KRAS野生型患者部分有效，疾病控制時間為6.5月。聯合治療中，沒有看到其他的抗腫瘤活性（76）。在BRAF突變的結直腸癌臨床前模型中，同時阻斷IGF-1R和MEK有效地抑制了EGFR-IGF1R之間的相互作用（77）。

結論

雖然EGFR靶向治療發展迅速，但是在結直腸癌治療的耐藥機制方面還有很多需要研究。顯然，KRAS基因12號密碼子突變是EGFR抑制劑耐藥的一個主要原因。在KRAS野生型中，很多因素與耐藥有關，包括配體的表達水平、PI3K或IGFR-1通路的激活。RAS基因13號密碼子突變和BRAF突變也是EGFR抑制劑耐藥的一個機制，值得進一步研究。確定EGFR抑制劑的耐藥機制有助于我們選擇病人進行個體化治療以及發展新的聯合治療手段來克服當前治療的耐藥問題。