蛋白質的磷酸化是指由蛋白激酶（protein kinase, PK）催化的把 ATP 或 GTP γ 位的磷酸基轉移到底物蛋白質的氨基酸殘基上的過程。其逆轉過程是由蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）催化的，稱為蛋白質的脫磷酸化（去磷酸化）（圖2）。作為一種基礎修飾類型，蛋白質的磷酸化和去磷酸化幾乎在每個生物的各個方面都扮演著重要的角色，例如基因轉錄、表達、細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導、免疫調控、腫瘤發生等。
圖2 蛋白質磷酸化反應示意圖[1]
生物體內磷酸化位點主要發生在 Ser（絲氨酸）、Thr（蘇氨酸）、Tyr（酪氨酸）殘基上，其中 Ser 磷酸化最多、Thr 磷酸化次之、Tyr 磷酸化最少。另外，His（組氨酸）、Asp（天冬氨酸）和 Lys（賴氨酸）殘基也可能被磷酸化。蛋白的磷酸化修飾是一種可逆修飾，蛋白激酶可催化蛋白發生磷酸化，而去磷酸化的逆過程是由蛋白磷酸酶催化的。人類樣本中已經證實的磷酸激酶有500多種，擬南芥中預測的磷酸激酶有1000余種。以乙醇基作為受體的磷酸轉移酶稱為蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶，以苯基為受體的磷酸轉移酶稱為蛋白酪氨酸激酶。很多癌癥研究中，都發現了蛋白激酶抑制劑作為癌癥治療藥物的巨大價值，比如慢粒白血病的特效藥“格列衛”就是一種酪氨酸酶抑制劑，靶向抑制腫瘤細胞中異常激活的酪氨酸激酶。目前磷酸化蛋白主要通過特異性抗體結合 Western Blot ，酶聯免疫吸附分析（ELISA），細胞內流式細胞術和免疫細胞化學/免疫組織化學（ICC/IHC）以及質譜等方法進行檢測。基于質譜的磷酸化蛋白質組具有高分辨、更全面等優勢，但由于磷酸化修飾的蛋白質在生物樣本中含量低且動態范圍廣，檢測前需要對發生修飾的蛋白質或肽段進行富集。因此如何提高磷酸化肽段富集時的選擇性、靈敏度、富集效率具有重要的研究價值，目前富集磷酸化肽段的技術分支有很多，比如：免疫共沉淀法（采用抗體富集）、固相金屬親和色譜（IMAC）、金屬氧化物親和色譜法（MOAC）等。不同技術各有優缺點，目前應用比較廣泛的富集方法是 IMAC 的 IMAC-Fe 與 MOAC 的 TiO2。IMAC-Fe 是利用磷酸化基團與固相化的 Fe3+金屬離子的高親和力來富集磷酸化多肽的。
蛋白質的磷酸化和去磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最普遍、也是最重要的調控機制，具有重要的研究價值，廣泛應用于微生物、植物和動物的研究中。磷酸化參與各種生理和病理過程，調控細胞的增殖、分化和凋亡，廣泛運用在信號轉導、信號通路、細胞凋亡、發育分化、癌癥機理等研究領域，下面就幾個研究比較多的方向進行簡單總結。
信號通路一般依賴信號蛋白上磷酸基團的傳遞。某蛋白在磷酸激酶的作用下，將磷酸集團傳遞給下游蛋白（可能是轉錄因子或下游激酶），使其發生磷酸化，同時上游激酶又激活該蛋白的磷酸化，形成多級激酶模式，實現信號的級聯放大。磷酸化蛋白質組可測得信號通路上高表達的磷酸化蛋白，進而找到表型相關的激活信號通路，解釋相關機理。例如：通過磷酸化蛋白質組學技術，分析體內 GPCR（G蛋白偶聯受體）信號通路中磷酸化蛋白及磷酸化位點，系統性地了解阿片類藥物對大腦的影響，有助于針對性地干擾級聯信號，減弱或消除藥物副作用[3]。
蛋白激酶可以通過影響信號通路上的蛋白的磷酸化，調節細胞的生長分化以及凋亡。例如，以裂殖酵母為研究模型，通過抑制劑處理，檢測不同細胞分裂時期酵母中的磷酸化蛋白質組，發現 CDK（周期蛋白依賴性激酶）對細胞分裂的影響是通過酶活閾值和底物特異性共同調控的[4]。
3）植物的抗逆、抗脅迫
在生物和非生物脅迫下，植物可以通過信號通路上蛋白的磷酸化或去磷酸化調節生長發育和脅迫應答之間的平衡，從而使植物具有一定的抗逆性。例如，磷酸化蛋白質組學發現植物雷帕霉素靶蛋白（TOR）激酶和脫落酸（ABA）受體偶聯的信號通路之間的磷酸化修飾作用，證明了植物利用這種保守的磷調節反饋機制來平衡生長發育和脅迫應答[5]。
圖7 植物通過 TOR 激酶和 PYL 蛋白磷酸化平衡生長發育和脅迫應答的模式圖磷酸化蛋白質組圖譜對于腫瘤的分子分型、致病機制研究和治療靶點選擇，都有著非常重要的研究意義。在腫瘤的大樣本量隊列研究中，磷酸化蛋白質組結合定量蛋白質組技術，可以對一些常見癌癥進行更精確的分子分型。在肝癌、乳腺癌中已有相應報道，例如，對159位 HCC（肝癌）病人的配對癌組織和癌旁肝組織進行多組學研究，在磷酸化蛋白質組部分，對差異表達的磷酸化蛋白進行通路富集，將腫瘤隊列分型，得到三種預后不同亞型[6]。
圖8 差異磷酸化蛋白的功能富集及不同亞型的預后情況
腫瘤組織中，某些磷酸化蛋白很可能本身是抑癌因子或者致癌因子，例如，對大樣本量結腸癌的癌及癌旁組織進行蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學隊列研究，發現結直腸癌中Rb蛋白的磷酸化可以促進細胞增殖，減少細胞凋亡，解釋了這種經典腫瘤抑制因子在結腸腫瘤中被擴增的原因[7]。
圖9 磷酸化的 Rb 蛋白作為結腸癌治療靶點的潛在機理
腫瘤組織中的磷酸化蛋白或蛋白激酶也可作為癌癥的治療靶點，例如，對于不同預后情況的三陰性乳腺癌（TNBC）癌組織進行磷酸化蛋白質組研究，發現了一組六種激酶驅動復發性 TNBC 的磷酸基序，在臨床模型中，通過六種激酶的抑制劑治療，發現靶向這些激酶的潛在治療效用[8]。
圖10 磷酸激酶抑制劑的治療效果
5）晝夜節律
蛋白磷酸化通過影響轉錄調控，細胞周期，代謝過程等，影響生物的晝夜節律，揭示了生物鐘的規律和內在調節機制，例如：對不同時間節點的小鼠肝臟取樣進行磷酸化蛋白質組檢測，發現小鼠肝臟磷酸化蛋白的表達水平每天大幅度振蕩，PCA 分析可以將磷酸化肽段分為晝、夜兩大類，且周期性變化的磷酸化蛋白功能符合生物活動和進食規律[9]。
圖11 磷酸激酶網絡和信號通路的時間調控情況
小編總結：
蛋白的磷酸化修飾作為一種基礎修飾，普遍存在于動物植物和微生物中，由于影響信號轉導、細胞周期、分化發育等各個方面，已經在生長發育、抗逆、癌癥等領域得到了廣泛的研究。
