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蛋白質電印跡是基于蛋白質免疫印跡法（Western blotting, WB）的蛋白質轉印法，但蛋白質電印記法使用固定化的膜，固定膜可抵抗蛋白質和肽序列進入測序儀之后的化學反應步驟。 由于其操作簡便，設備成本低以及與基于Edman降解法測序儀的兼容性，蛋白質電印跡法被廣泛用作蛋白質微量樣品的制備。PVDF膜也替代了初代使用的多堿涂層或四分之一玻璃纖維紙，成為最佳選擇。如今PVDF膜為了實現最高的轉印效率，可對多種不同的參數（印跡條件，膜類型）進行選擇，如具有高蛋白結合能力（100±200 mg / cm2），可以通過常規蛋白染色程序等類型。 帶有目標蛋白點的膜被切下來，進行進一步的分析。可以通過測序儀進行蛋白質N端測序，也可以將結合的蛋白從膜上洗脫下來，進行序列分析。使用直接印跡法測序，鑒定出的殘基數量一般不會超過三十個循環。而且，當對極少量蛋白質樣品進行測序時，在苯基硫代乙內酰脲氨基酸（Ser，Thr，Arg，His）等低豐度氨基酸殘基或修飾殘基的位置經常會遇到問題。此外，蛋白質N末端在生物合成過程中（乙酰化，甲酰化或焦谷氨酰基形成），經常會被封閉。隨著分析蛋白質的數量減少，科學家們很難對經常注意到的不同類型的N末端阻滯進行解釋。科學家們推測是由于與緩沖液中存在的痕量化合物發生反應，或由未完全聚合的凝膠中存在的游離氨基與游離丙烯酰胺反應引起的。這也歸因于蛋白質功能基團和用于檢測蛋白質的染色劑之間的相互作用。由于這些限制，也因為N端測序是一項只有一次機會的試驗，不能對已經上機的樣品進行二次檢測。于是Aebersold等提出了原位裂解的策略。在原位裂解法中，固定的蛋白質用特定的蛋白酶（例如胰蛋白酶，內切蛋白酶Asp-N或內切蛋白酶Lys-C）消化。在消化后的混合物中，最親水的肽會從膜上解離，可以通過窄孔或微孔反相液相色譜對其進行分離。從而可以對每種純化得到的短肽進行單獨測序。這種方法比直接的N端測序靈敏度低（由于需要額外的步驟），但是它能夠繞過蛋白質阻滯和生成目標蛋白質內部序列的多個片段的優勢，為選擇不同的序列和提高蛋白鑒定打分提供了條件。 除原位消化外，蛋白質裂解還可以在凝膠中進行，凝膠內的肽混合物通常會帶有來自凝膠本身或染色劑中的雜質。也有研究認為當結合的蛋白質含量低于一定水平（通常估計為10 μg蛋白質/ cm2）時，原位消化可能會失敗。當單個斑點中蛋白質含量不足時，可以通過將凝膠中的樣品進行合并后，重新洗脫蛋白質，然后重新濃縮的方法解決這一問題。 基于Edman降解法的方法通常速度較慢，因為每個蛋白質斑點或肽峰都必須進行單獨測序。在這些情況下，很難實現高通量分析。盡管如此，第一個2-D凝膠蛋白數據庫是以Edman降解測序獲得的。它通過算法將獲得的蛋白序列與數據庫中的序列信息進行比對，實現蛋白質的鑒定。通過對算法的不斷改進，近代隨著算法的容錯率大大增加，能夠實現僅僅具有相識性就能對蛋白質進行識別，而且還能在給定物種的相同家族成員數據之間進行比對。在這些研究中，蛋白質組學所基于的所有基本原理都得以使用。當開始大規模基因組測序并伴隨著生物質譜分析能力的不斷提高時，這個“靜止”狀態的學科開始活躍起來。通過兩種科學方法的結合，從大規模蛋白質組學的角度進行思考變得現實。而這一切，都得益于基于MALDI技術的發展，下一節開始將對圍繞MALDI技術進行詳細介紹。 北京百泰派克公司采用高分辨率質譜平臺技術，包括Thermo Fisher的Q Exactive質譜儀，LTQ Orbitrap Velos質譜儀，以及AB SCIEX的6500 Q TRAP質譜儀，結合 Nano-LC高通量液相色譜技術，能夠對SDS-PAGE蛋白條帶、2D蛋白膠點等樣品中的蛋白質進行高效精準鑒定。膠條、膠點蛋白質譜鑒定服務可保證100%的鑒定率，否則不收任何費用。 |
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