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盡管MALDI原則上是一種軟電離技術，幾乎只產生完整的生物分子離子，但MALDI在電離過程中會形成相當程度的亞穩態離子。對于肽和蛋白質離子，這種亞穩定的離子行為不僅會引起中性小分子（如水和氨）的損失，還會引起多種肽鍵斷裂。MALDI-MS中有兩種不同類型的碎片反應：（i）在激光撞擊后幾百ns內，質譜儀的離子源附件的離子的“迅速碎片” （prompt fragmentation）和（ii）PSD則需要較長一些的時間（μs），在將來源于MALDI的離子從離子源提取到RETOF質譜儀的第一個無電場區域的過程。一般認為，分析物離子在萃取過程中的碰撞激活，以及在電離過程后能量過剩的離子的單分子衰變，都被認為是造成PSD現象的原因。 由于PSD發生在無電場區域，碎片離子的速度與其完整的母離子保持相同的速度，因此在線性MALDI-MS光譜中不能被觀察到。可以通過用一個靜電離子鏡或“場電子場”代替無場區末端的檢測器，這會顛倒入射離子的飛行路徑，碎片離子就可以從其完整的母離子中分離出來。由于它們的動能較小，它們不像完整離子那樣深入反射層，因此會更早地從該場中彈出，并且在MALDI-RETOF-MS光譜中的表觀質量會低于其前體離子。由于大多數反射電子場在給定的電壓設置下僅具有有限的動態分離范圍，因此需要將其逐步降低到較低的電壓，以便分離和聚焦整個目標碎片質量范圍（通常可以獲得10-15個片段）。一旦反射電子場通過人工合成的已知肽段進行了校準，即可將片段光譜膠合在一起以形成PSD光譜，這時所有片段離子的質量都可以確定。也可以使用彎曲場反射器，將場幾何（field geometry）同時應有于分離和聚焦產生的所有碎片離子，從而避免使用單級或雙級反射器的耗時的電壓漸進過程。 通過研究肽離子的MALDI-PSD片段，可以推測PSD是酰胺鍵斷裂的主要結果，非常類似于低能碰撞活化解離（CAD）誘導的肽的片段化行為。如，N末端碎片離子（a，b，c和d型碎片），C末端碎片離子（x，y和z型碎片）以及由同一前體離子的多次碎片化而產生的內部碎片均能在MALDI-PSD光譜中觀察到。此外，由于小片段中性分子（如絲氨酸和蘇氨酸殘基中的水以及賴氨酸和精氨酸中的氨）的損失，PSD碎片離子會出現衛星峰。且PSD碎片主要發生在肽鍵上，因此在MALDI-PSD光譜中主要觀察到b型和y型碎片離子。由于PSD光譜的高度復雜性（主要是由各種強烈的內部片段化，缺乏完整的肽主鏈片段化以及高質量片段的質量準確性低引起的），所以很少將MALDI-PSD用于蛋白質譜鑒定。此外，當在MALDI質譜儀的離子源中使用延遲萃取時，前驅體離子被冷卻，這與使用連續離子萃取的質譜儀中的PSD相比，碎片效率降低。PSD的降低效應可能非常高（一個數量級），但會通過碎片離子的分辨率和準確性（碎片同位素分辨率超過1000 Da）進行補償。盡管有這些缺點，但最近幾年也有許多研究表明，隱藏在PSD光譜中的序列信息可以幫助甚至指導蛋白質譜鑒定。 盡管MALDI-PSD光譜圖比較復雜，但在許多情況下仍可獲得序列信息，如肽序列中一個或幾個連續氨基酸的準確位置。而且，已經證明使用帶有質量標記的末端會使光譜解釋起來更容易。一個成功的例子是在蛋白質消化過程中用18O同位素部分標記C末端的羧基部分。在MALDI-PSD光譜中，包含C末端18O同位素標記（主要是y和z型離子）的片段可以很容易地與包含N端的片段區分開（例如，參見圖1）。通過減去標記片段離子的質量，可以獲得氨基酸殘基質量，從而實現短氨基酸片段的從頭測序。一旦獲得了序列信息，就可以通過算法使用蛋白質和DNA數據庫來識別目標蛋白質。數據庫如： ProteinProspector的Ms-Tag和Ms-Seq：http://prospector./prospector/mshome.htm； PepFrag算法：http://prowl./； PeptideSearch：http://peptsearch./FR_PeptidePatternForm.html。  圖1. MALDI-PSD分析示例。通過MALDI-PSD光譜法，對SDS-PAGE獲得的來自人源14-3-3蛋白進行胰蛋白酶消化后得到的肽段NH2-EMQPTHPIR-COOH，進行蛋白質質譜鑒定。在胰蛋白酶消化過程中摻入18O同位素，可以部分標記C末端，從而可以在PSD光譜中分離所有包含該標記的肽片段。圖中顯示了衍生的肽通過y離子標簽（385.49到522.54 m/z）搜庫，該標簽用于在只包含人源蛋白的非冗余蛋白數據庫中識別該蛋白。 有研究表明，PSD片段化可以受多肽化學修飾的影響，如果通過序列標簽的方式可以更容易的驗證。一種方法是通過使用氯磺酰乙酰氯引入一個負電荷的方式，對肽N末端的氨基進行修飾。在MALDI-PSD光譜中，含有負電荷N端的片段被大大抑制，主要出現的是y離子，以及較y型離子少的z型離子。此外，大大提高了修飾肽的整體片段化效率，使MALDI-PSD對肽序列進行從頭測序成為可能。但是，該方法仍然僅限于缺少賴氨酸殘基的肽。 Yates等最初將串聯質譜MS用于質譜蛋白質鑒定的研究人員，對SEQUEST算法進行升級，將不能破譯的MALDI-PSD譜圖與數據庫中可用的已知肽段氨基酸序列關聯起來。通過這一改進，大大降低了手動分析PSD獲取的光譜圖的時間。MassFrag的算法，能夠指出肽的理論片段譜與一小部分候選肽中的實驗PSD譜的最匹配信息。使用這種方法，我們能夠明確地識別肽質量指紋圖譜的蛋白質，哪些由于精確測量的肽質量的數量少或因為樣品的復雜性的蛋白質也能被識別。一種使用片段化規則從PSD光譜生成大量從頭氨基酸序列的算法，提出將氨基酸序列用于掃描數據庫中存在的相同或同源序列，從而實現所對分析蛋白質的鑒定。 科學家們，成功地使用了從MALDI-PSD光譜中存在的片段化信息來進行蛋白質譜鑒定。為了充分利用這種蛋白質鑒定技術在蛋白質組學領域的潛力，科學家們嘗試創建可以在龐大的序列數據庫中進行更快，更特異性的蛋白質鑒定的算法。通過簡單地重新索引并以一種簡化且易于訪問的格式存儲實際序列數據，可以在幾秒鐘內獲得大量的非冗余蛋白質數據庫。 本文由百泰派克生物科技整理編輯。 北京百泰派克公司采用高分辨率質譜平臺技術，包括Thermo Fisher的Q Exactive質譜儀，LTQ Orbitrap Velos質譜儀，以及AB SCIEX的6500 Q TRAP質譜儀，結合 Nano-LC高通量液相色譜技術，能夠對SDS-PAGE蛋白條帶、2D蛋白膠點等樣品中的蛋白質進行高效精準鑒定。膠條、膠點蛋白質譜鑒定服務可保證100%的鑒定率，否則不收任何費用。 文獻參考：Protein identification methods in proteomics. Electrophoresis, 2000. |
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