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MALDI-TOF-MS最初用于等分試樣（1μL或更少）樣品的質譜鑒定，用于檢查肽的純度或PMF。大批量的樣品測定，往往使用Edman降解法測序或ESI-MS，如四極（Q）-TOF-MS 質譜。做出以上選擇的原因，主要是因為MALDI技術進行分析，上樣量不能超過0.5μL。這種樣品制備方法極大地限制了MALDI技術檢測的整體靈敏度，并且還限制了可以分析的肽濃度，因為肽和基質共結晶過程的質量對于檢測的靈敏度和準確性都非常重要。MALDI技術通常將等體積的樣品和MALDI基質溶液混合，將肽混合物干燥，連續洗滌使用預制型的薄層基質。該方法為精確和靈敏的MALDI檢測創造了最佳條件。然而，這種樣品制備方法制備的樣品不能承受激光輻射，會被迅速漂洗。因此，該方法不適用于PSD光譜的蛋白質譜鑒定，因為PSD光譜法通常每個片段質量范圍需要多達100甚至以上次數反復的激光輻射。 如果在分析之前，使用小型吸附柱對較大體積的肽混合物進行濃縮，抑或通過向肽混合物中添加少量反相色譜珠的方式進行批量吸附。而進行批量吸附，只需要將磁珠吸附到的肽混合物進行洗滌，即可獲得肽混合物，然后轉移至上樣處并干燥即可。這種批量吸附濃縮的方法（i）可以將肽濃縮幾個數量級，（ii）可以用作純化步驟，并且（iii）可以形成形成微晶的條件，我們前面提了這些微晶可以應對大量的激光輻射，從而為PSD分析創造條件。 這一方法，可以實現少于200摩爾的肽/ μL的樣品也可用于PSD法進行分析。 通過降低樣品表面積是另一個增加檢測靈敏度的方法，最佳的情況下，樣品的表面積可以小于激光束的直徑。要實現這一要求，可以通過在上樣板上增加疏水性表面（例如，特氟隆）的方法來實現。當樣品液滴放置在加樣板上時，肽在蒸發的過程中濃縮成較小的體積。通過這一改進，可以實現亞摩爾級別蛋白樣品的質譜鑒定。目前，與寡核苷酸檢測類似，如果在疏水環境中創建一個小的親水位點，以避免肽基質在疏水板表面的隨機結晶。理想條件下，樣品會在這個小親水位點處結晶，從而提高整體測量的靈敏度。處理少量樣品時，另一個引起注意的問題是角蛋白的污染，這種蛋白主要來自人類或綿羊的汗液。只需要采取簡單的預防措施，例如使用新鮮制作的緩沖液和溶液（凝膠溶液，電泳緩沖液染色溶液，消化緩沖液）以及限制凝膠在空氣中的暴露時間（例如，在染色過程中），即可避免該問題。 在MALDI-MS方法中，蛋白質膠樣質譜鑒定過程中，多肽的回收是一個問題。如下圖所示，將膠樣中同樣的20 ng兔骨骼肌肌動蛋白用不同的染色法進行染色：常規銀染色（無戊二醛）與鋅-咪唑鋅陰性染色法。染色后，用胰蛋白酶在凝膠中對蛋白質進行消化，磁珠法對樣品進行濃縮，用MALDI-MS進行蛋白質譜鑒定。結果發現，與陰性染色的蛋白質相比，蛋白質的銀染色導致胰蛋白酶肽的回收率降低（比較圖中左右兩邊肽的S / N比率）。該影響可通過去除蛋白質染色過程中銀染試劑的方式消除。  圖注：20 ng (500 fmol)兔骨骼肌肌動蛋白經胰酶消化后，MALDI技術分析得到的肽指紋圖譜。使用1-D SDS PAGE膠分離后的目標蛋白分別使用：無戊二醛的銀染法（圖左）和Zn2+-imidazol染色法（圖右）進行染色。切膠后用胰蛋白酶進行消化，使用多孔 R2磁珠進行濃縮，DE-MALDI-RETOF-MS分析，得到胰蛋白酶肌動蛋白肽的質量及其S/N(斜體)比率。 |
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