【原】【雷說新藥】突破乙肝治愈困境的生力軍——RNA療法

新康界pro 2020-09-04

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乙肝流行情況

乙型肝炎是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染人體肝臟引起的急性或慢性肝病。當人體的免疫系統不能消滅HBV，導致其在血液和肝臟中持續存在，則形成慢性HBV感染，其中較大一部分表現為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)，通常簡稱為“慢乙肝”。

隨著HBV疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白的普及，HBV感染的預防取得了顯著成果，從1980年代至2015年，5歲以下兒童新發感染率從4.7%降到了1.3%，但是存量患者群體仍然非常龐大。根據世界衛生組織(WHO)發布的2017年全球肝炎報告，2015年全球約有2.57億慢性HBV感染者，當年新確診的感染者有2200萬人，其中僅有170萬(8%)得到治療。全球每年近90萬人死于慢性HBV感染進展的疾病，包括肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌。

據中國肝炎防治基金會估算，2020年我國乙肝病毒感染者約7000萬人，需要治療的約2000多萬，能夠接受規范治療的只有11%。中國肝癌的死亡順位由1990年的11位上升到2017年的第7位，肝癌患者中86%感染了乙肝病毒，6.7%為乙肝病毒和丙肝病毒合并感染。慢性HBV感染在全球范圍內巨大的患者群體和較低診療率，意味著巨大的市場空間。

圖表1. 2015年全球慢性HBV感染者地區分布

來源：世界衛生組織、中康產業資本研究中心

乙肝病毒生命周期

HBV是一種獨特的嗜肝DNA病毒，通過與肝細胞膜上受體，如鈉離子-牛磺酸協同轉運蛋白(NTCP)相互作用，去除乙肝表面抗原(HBsAg)包膜蛋白和磷脂包膜。剩余的核心顆粒進入肝細胞，再脫除核衣殼，即乙肝核心抗原(HBcAg)，將松弛環狀的雙鏈DNA(RC DNA)運輸至細胞核內。在HBV DNA聚合酶的作用下，RC DNA的缺口被補齊，形成共價閉合環狀DNA(cccDNA)。以cccDNA為模板，轉錄產生前基因組RNA(pgRNA)和其他3種mRNA(preSRNA、SRNA、XRNA)，這些RNA翻譯得到聚合酶(Pol)、HBc蛋白、pre-core蛋白、表面蛋白(S、LS、MS)和HBx蛋白。前基因組RNA出核后，在逆轉錄酶和聚合酶的作用下形成RC DNA，與核衣殼蛋白(HBc)組裝成核心顆粒。核心顆粒可再次進入細胞核補充cccDNA，或者在內質網(ER)組裝成完整的病毒粒子，以出芽的方式脫離細胞，再去感染鄰近的肝細胞。

此外，pre-core蛋白可以經過蛋白水解，在內質網內形成乙肝e抗原(HBeAg)，3種表面蛋白(S、LS、MS)則在內質網形成乙肝表面抗原(HBsAg)。HBeAg和HBsAg這兩種蛋白可以分泌到細胞外，而不必組裝成完整的病毒粒子。受感染肝臟細胞釋放的大量HBsAg會導致T細胞耗竭，產生免疫抑制效果，在維持HBV感染的持久性中起重要作用。

圖表2. 乙肝病毒生命周期及相關療法

來源：公開信息、中康產業資本研究中心

慢乙肝的治愈類型

慢乙肝治愈的類型包括完全治愈(病毒學治愈)和臨床治愈(功能性治愈/免疫學治愈)。完全治愈(病毒學治愈)即血清HBsAg檢測不到，肝內和血清HBVDNA清除(包括肝內cccDNA和整合HBV DNA)，血清抗-HBc持續陽性，伴或不伴抗-HBs出現。HBV cccDNA可在肝細胞核內形成微染色體，具有高度穩定性，無需新的病毒進入肝細胞即可自我補充(圖表2中3-4-5-7-8-9-3的循環)。此外，HBV可以將雙鏈線性DNA整合到宿主DNA中，整合的基因組片段不能表達核心蛋白，但可以持續表達HBsAg。獨特復雜的基因組和復制模式使HBV難以從體內徹底清除。

臨床治愈(功能性治愈/免疫學治愈)指完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到，HBeAg陰轉，伴或不伴HBsAg血清學轉換(指HBsAg轉陰且抗-HBs轉陽)，殘留cccDNA可持續存在，肝臟炎癥緩解和肝組織病理學改善，終末期肝病發生率顯著降低。

圖表3. 慢乙肝的完全治愈和臨床治愈

來源：2019慢乙肝臨床治愈專家共識、中康產業資本研究中心

現有療法的局限

慢乙肝目前已批準的療法包括直接作用于HBV生命周期中逆轉錄和DNA合成環節(圖表2中8-9)的直接抗病毒藥物(DAA)，即核苷(酸)類似物(NA)，以及免疫調節劑干擾素(IFN)類。

NA可強效抑制HBV復制，但不能直接抑制cccDNA的轉錄活性(圖表2中4)，從而無法有效抑制各種病毒蛋白如HBsAg的表達。長期治療后，cccDNA和HBsAg水平會逐漸下降，但HBsAg的陰轉率僅有0~3%，如果不轉陰則意味著未達到臨床治愈。最嚴重的是，NA停藥后HBV會迅速復制，這意味著患者需要長期甚至終身用藥。

圖表4. 全球用于乙肝治療的已上市的核苷(酸)類似物

來源：公開信息，中康產業資本研究中心

干擾素中具有抗乙肝病毒作用的為干擾素α(IFNα-2a、IFNα-2b)，以及長效的聚乙二醇化干擾素α(PEG-IFNα-2a、PEG-IFNα-2b)。干擾素通過增強免疫細胞功能、促進細胞因子表達、誘導并編碼多種抗病毒蛋白等作用于HBV的復制、轉錄等過程，發揮免疫調節和抗病毒的雙重作用。干擾素可以增強HBV前基因組RNA(pgRNA)和核心顆粒的降解，抑制cccDNA的轉錄，從而減少病毒蛋白如HBsAg的表達。相比NA，干擾素單獨使用療程有限，效果稍好，如PEG-IFN單藥治療HBsAg陰轉率為3%~7%。然而，干擾素僅對部分患者有效，且耐受性較差。核苷(酸)類似物和干擾素除了單獨使用，也在被探索聯合療法，但最佳聯用策略，如具體藥物選擇、劑量、療程、同時給藥、序貫治療等，目前尚未確立。

慢乙肝現有療法能夠在一定程度上抑制HBV，部分逆轉炎癥和纖維化，能夠降低但不能消除肝細胞癌風險。現有療法的主要局限是對HBsAg清除率低，不能實現臨床治愈，更不能根除cccDNA和整合DNA實現完全治愈。慢乙肝現有療法的局限意味著巨大的未被滿足的臨床需求，因此全球許多制藥企業和研發機構都在努力探索能夠提供臨床治愈甚至完全治愈的創新療法。

慢乙肝的在研創新療法

治療慢乙肝的方向可以分為直接抗病毒藥和免疫調節劑，前者針對病毒生命周期各環節，后者則針對人體的免疫系統(圖表5)。目前針對HBV復制周期的各環節，均有一些在研創新療法，包括病毒進入抑制劑、cccDNA切割、轉錄抑制劑、聚合酶抑制劑、衣殼阻滯劑和釋放抑制劑。免疫調節劑包括針對先天性免疫的Toll樣受體(TLR)小分子激動劑和PD-1單抗，針對適應性免疫的治療性疫苗和工程化T細胞。現有的核苷(酸)類似物(NA)療法多為逆轉錄抑制劑，針對此機制的在研創新療法較少。

圖表5. 全球用于乙肝治療的創新療法(部分)

來源：公開信息，中康產業資本研究中心

在創新療法中，進入抑制劑(entry inhibitors)只能用于預防病毒感染，對于已進展為慢性感染的患者則無法發揮治療作用，而且對于HBV進入肝細胞的具體機制目前并不完全清楚，開發風險較大。直接針對cccDNA的基因編輯尋求慢乙肝完全治愈，但是可能存在倫理和脫靶引起的安全性問題。免疫調節劑主要是生物制品，開發難度較大，已有眾多治療性疫苗失敗。

聚合酶抑制劑、衣殼阻滯劑和釋放抑制劑，相對于轉錄抑制劑處于HBV復制周期的下游，并不能直接阻止病毒各種蛋白如HBsAg的表達。HBsAg陰轉是慢乙肝臨床治愈的重要目標，因此直接影響cccDNA轉錄和翻譯(圖表2中4-5)的轉錄抑制劑在作用機制上可能具有一定優勢，目前較多的在研療法也印證了這一點(圖表5)。HBV轉錄抑制劑大多是基于RNA干擾(RNAi)機制的療法，屬于RNA療法。

RNAi(RNA interference，RNA干擾)的機制是長雙鏈RNA(dsRNA)或短發卡結構RNA(hairpin RNA)被核酸內切酶Dicer剪切為siRNA，再與蛋白質結合形成RNA誘導沉默復合體(RISC)，在解旋酶作用下脫去正義鏈，帶有反義鏈的RISC再與特定mRNA特異互補，降解mRNA或抑制其翻譯，達到靜默特定基因表達的效果(圖表6)。由于RNAi技術可以特異性靜默特定基因的表達，被積極用于開發針對罕見病、癌癥、病毒性疾病等的基因療法。

圖表6. RNAi的基本作用機制示意

來源：Asian J. Pharm.、中康產業資本研究中心

RNA療法

RNA療法的機理是使用能夠與mRNA通過堿基配對結合的寡核苷酸來影響mRNA的代謝。這些過程包括從mRNA前體(pre-mRNA)開始的mRNA剪接和成熟過程、mRNA的運送、mRNA的蛋白轉譯，以及mRNA的降解。目前RNA療法主要包括ASO(反義寡核苷酸)、siRNA(小干擾RNA)和miRNA(小分子RNA)(圖表7)。

圖表7. RNA療法中三類藥物的比較

來源：公開信息、廣證恒生、中康產業資本研究中心

ASO藥物發現最早，獲批藥物較多。1998年FDA批準了首個ASO藥物，Ionis公司的Vitravene(fomivirsen)，用于二線治療艾滋病人并發的CMV(巨細胞病毒)視網膜炎。2016年，Biogen/Ionis的ASO藥物Spinraza(nusinersen)獲批，成為首款治療兒童和成人脊髓型肌萎縮癥(SMA)的療法。2018年，Ionis公司的Tegsedi(inotersen)獲批，成為首款治療遺傳性轉甲狀腺素介導的淀粉樣變性(hATTR)的療法。

ASO藥物是可以直接與靶標mRNA相結合的單鏈寡核苷酸，親水性比雙鏈寡核苷酸弱，通過磷硫酰化提高穩定性，增強與蛋白質的結合和組織擴散的能力。與ASO藥物不同，siRNA藥物是雙鏈寡核苷酸，親水性強，在組織中擴散和被細胞吸收的效果都不好。對于雙鏈寡核苷酸的修飾主要有兩種方法，一種使用脂質納米顆粒幫助運送到靶點組織(主要是肝細胞)并保護核苷酸不被降解，另一種使用N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)修飾促進siRNA被肝細胞靶向吸收。由此可見，siRNA藥物的修飾方法帶來的肝臟靶向性有利于研發治療慢乙肝的創新療法。

2018年FDA批準了全球首個siRNA藥物，Alnylam公司的Onpattro(patisiran)，也是首款用于治療成年患者由hATTR引起的多發性神經病的療法。2019年11月，Alnylam公司的又一款siRNA藥物Givlaari(givosiran)獲得FDA批準，用于治療患有急性肝卟啉癥(AHP)的成年患者。隨著藥物遞送問題的突破，siRNA藥物將逐漸成為主流的RNA療法。miRNA只需要2-8位核苷酸配對就能發揮作用，通常作用于一個協同的網絡而非單條通路，相關技術還需要繼續研究。

慢乙肝的在研RNA療法介紹

針對慢乙肝的siRNA藥物主要靶向乙肝病毒的前基因組RNA(pgRNA)和3種mRNA(圖表2中4)，而ASO藥物通過與病毒mRNA結合阻止其翻譯為病毒蛋白從而抑制病毒復制。近年來有多款siRNA藥物和ASO藥物進入臨床試驗階段，尋求慢乙肝的臨床治愈(功能性治愈/免疫學治愈)。

2020年8月27日-29日(中歐夏季時間)，歐洲肝病研究學會(EASL)組織的2020年國際肝病年會(ILC 2020)在線上召開。EASL是世界權威的肝病研究學會，其組織召開的ILC是全球肝臟病學領域最具影響力的國際會議之一。ILC展示肝病領域最佳臨床實踐和科學，介紹肝病學的最新趨勢，呈現科學前沿進展。ILC2020 公布了全球范圍內慢乙肝RNA療法的最新進展，下面擇要介紹。

JNJ-3989

楊森(Janssen)與RNA療法公司Arrowhead于2018年10月簽訂協議，合作開發和商業化siRNA藥物JNJ-3989(ARO HBV)。ILC 2020公布了JNJ-3989與核苷(酸)類似物(NA)聯用治療慢乙肝1/2期研究(AROHBV1001)的2期臨床數據。數據分析的目的是評估研究從開始到結束(第392天，服用最后一劑JNJ-3989的48周后)，HBsAg、HBV RNA、HBeAg和乙肝核心相關抗原(HBcrAg)的持續應答。持久應答者定義為從第0天-第392天持續表現為HBsAg下降≥1log₁₀IU/mL(1個指數單位)的慢乙肝患者。

圖表8. siRNA藥物JNJ-3989+NA聯合療法作用機制示意

來源：Janssen、中康產業資本研究中心

分析結果顯示：97.5%的患者接受治療后HBsAg水平降低1個指數單位以上，并且在最后一劑JNJ-3989給藥后48周內，39%(15/38)的患者表現為持久應答；(2)HBV RNA、HBeAg、HBcrAg的降低在所有隊列都可見，且在HBsAg持久應答者中更明顯；(3)JNJ-3898的試驗劑量顯示出良好的耐受性，似乎具有良好的長期安全性。分析結果支持對JNJ-3989+NA聯合療法進行更長時間的評估，目的是實現慢乙肝的功能性治愈。

GSK3228836

2019年，葛蘭素史克(GSK)以高達2.62億美元的里程碑付款和相應的銷售分成，從專注于開發反義寡核苷酸(ASO)藥物的Ionis公司獲得了兩款乙肝在研療法的研發和推廣權益，其中一款為GSK3228836(GSK836，ISIS 505358)。該藥是針對所有HBV RNA的2'-MOE(甲氧基乙基)修飾的反義寡核苷酸，通過核糖核酸酶H1誘導細胞核和細胞質中HBV RNA的切割。

ICL 2020公布了GSK836的臨床2a期試驗數據，包括未經治和接受穩定核苷(酸)類似物(NA)穩定治療≥12個月的慢乙肝患者，在第1、4、8、11、15和22天皮下注射GSK836(300mg)或安慰劑。對HBV影響的主要評估在第29天進行，隨后進行為期6個月的隨訪，觀察GSK836能否持續顯著降低HBsAg和HBV DNA低于定量檢測下限。

結果顯示，對于NA經治的患者，接受GSK836治療的4例患者中有3例的HBsAg降幅超過3個指數單位，其中1例低于檢測下限，另有1例患者在第36天低于檢測下限。對于NA未經治患者，接受GSK836治療的12例患者中有3例的HBsAg降幅超過3個指數單位對于6位接受GSK836治療的患者HBsAg水平下降3個指數單位以上，其中2例低于檢測下限(圖表9)。對于接受GSK836治療的16例患者，其中4例的HBsAg水平降到檢測下限之下，可視為實現了功能性治愈，治愈率25%。GSK計劃年底開始GSK836的2b期臨床試驗。

圖表9. 第29天檢測到患者的HBsAg水平變化

來源：ICL 2020、中康產業資本研究中心

VIR-2218

2017年10月，領先的RNAi療法公司Alnylam與專注開發嚴重感染性疾病藥物的Vir Biotechnology簽訂獨家許可協議，授權后者臨床開發和商業化HBV項目VIR-2218(ALN-HBV02)。該藥通過皮下注射給藥，是首個采用Alnylam公司的ESC+(增強穩定化學+)技術創制的GalNAc共軛siRNA藥物。在VIR-2218的雙鏈RNA結構中，正鏈上連接的GalNAc保證肝臟靶向性，負鏈中的乙二醇核苷酸(GNA)修飾既可增強體內效能所需的代謝穩定性，又能減少序列匹配脫靶效應。VIR-2218靶向HBV全部轉錄物共有的HBx基因區域，旨在沉默全部10種基因型HBV的cccDNA和整合DNA的轉錄。

圖表10. VIR-2218的結構和作用機制示意