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Microbiome definition re-visited: old concepts and new challenges Microbiome [IF:11.607] DOI：https:///10.1186/s40168-020-00875-0 發表日期：2020-06-30 第一作者：Gabriele Berg, Daria Rybakova, Doreen Fischer, Kellye Eversole, Linda Kinkel, Michael Wagner, Angela Sessitsch和Michael Schloter(8個共一) 通訊作者：Gabriele Berg (gabriele.berg@tugraz.at)，Michael Schloter（schloter@helmholtzmuenchen.de） 合作作者: Tomislav Cernava, Marie-Christine Champomier Vergès, Trevor Charles, Xiaoyulong Chen, Luca Cocolin, Gema Herrero Corral, Maria Kazou, Lene Lange, Nelson Lima, Alexander Loy, James A. Macklin, Emmanuelle Maguin, Tim Mauchline, Ryan McClure, Birgit Mitter, Matthew Ryan, Inga Sarand, Hauke Smidt, Bettina Schelkle, Hugo Roume, G. Seghal Kiran, Joseph Selvin, Rafael Soares Correa de Souza, Leo van Overbeek, Brajesh K. Singh, Aaron Walsh 主要單位： 1奧地利格拉茨工業大學，環境生物技術(Environmental Biotechnology, Graz University of Technology, Graz, Austria)  摘要 文章基于2019年3月6日在奧地利舉行的研討會框架中的討論。 根據1988年Whipps等人提供的簡短、清晰和全面的描述，提出了微生物組的定義，并根據最新的技術發展和研究成果，對其進行了一系列新穎的建議。 明確區分了微生物組（microbiome）和微生物群（microbiota）的術語，并提供了一個全面的討論，考慮微生物群的組成，微生物群的異質性和時間和空間動態，微生物網絡的穩定性和彈性，核心微生物群的定義，以及功能相關的關鍵物種。 從微生物（microorganisms）到微生物組（microbiome）:歷史概述  文字內容略。 定義微生物組：當前的定義和不足  微生物群落通常被定義為生活在一起的微生物的集合。更具體地說，微生物群落被定義為多物種組合，微生物有機體在一個連續的環境中相互作用。 1988年，Whipps首次給出了微生物組這個術語的定義。他們把“微生物組”描述為“micro微”和“biome生物組”兩個詞的組合，并把“在一個合理定義的棲息地中具有獨特的理化性質”的“特征微生物群落”稱為它們的“活動場所”。這一定義代表了微生物群落定義的實質性進展，因為它定義了具有獨特特性和功能的微生物群落及其與環境的相互作用，導致特定生態位的形成。然而還有許多其他的微生物組定義（如基于生態的定義，生物/宿主驅動的定義，基因/方法驅動的定義，混合定義等等，具體見原文）。 這些定義意味著宏觀生態學的一般概念可以很容易地應用于微生物與微生物以及微生物與宿主的相互作用。然而，這些從宏觀真核生物發展而來的概念，在多大程度上適用于休眠、表型變異和水平基因轉移等生活方式不同的原核生物以及微真核生物，尚不十分清楚。 這提出了一個全新的微生物群落生態學概念模型和理論的挑戰，特別是在微生物相互作用的不同層次，宿主生物，及非生物環境。當前的許多定義未能捕捉到這種復雜性，并將術語微生物組描述為只包含微生物的基因組。 修訂后的概念框架將允許我們從分類微生物轉向對微生物的功能及其與環境的相互作用的更全面的觀點。修正包括(1)微生物組的成員,(2)微生物組的成員之間的相互作用和微生物網絡,(3) 微生物時空特征,(4)核心微生物群,(5) 從功能預測到物種的表型,(6)微生物-宿主或環境互做和共同進化。下面將詳細討論這些方面。  1. 微生物組的成員  微生物群（microbiota ）包括形成微生物組的所有活的成員。 細菌、古菌、真菌、藻類和小型原生生物應被視為微生物組的成員。 而噬菌體、病毒、質粒和可移動遺傳元件的整合是微生物組定義中最具爭議的觀點之一。 關于從死細胞中提取的細胞外DNA(relic DNA)是否屬于微生物組，也沒有明確的共識。這種遺跡DNA可占土壤中已測序DNA的40%，在更廣泛的棲息地分析中，遺跡DNA平均可占細菌總DNA的33%，其中在一些樣品中最高比例為80%。盡管遺跡DNA無所不在且數量豐富，但它對分類和系統發育多樣性的估計影響極小。 微生物群（microbiota）通常被定義為存在于特定環境中的活的微生物的集合。 噬菌體、病毒、質粒、朊病毒、類病毒和游離DNA通常不被認為是活微生物，它們不屬于微生物群。但是他們屬于微生物組。 微生物組這個術語有時也會與宏基因組混淆。然而宏基因組被明確定義為來自微生物成員的基因組和基因的集合。 目前的物種定義是基于生物之間的DNA同源性，比如DNA-DNA雜交超過70%的DNA相似性，或者是平均核苷酸相似度。與真核生物相似，微生物菌株或生態型是分類和功能的基礎。 由于水平基因轉移(HGT)的頻繁發生，確定的菌株的穩定性是最關鍵的問題。后者是由質粒、噬菌體、轉座子等可移動遺傳元件從一個菌株轉移到另一個菌株，導致不可避免的基因組改變，強烈影響菌株的穩定性。 關于70%DNA雜交的歷史，我之前寫過： 2. 微生物網絡與相互作用 微生物之間相互作用對微生物的適應度、種群動態和菌群內的功能產生不同的結果。相互作用既可以發生在同一物種的微生物之間，也可以發生在不同物種、屬、科和生命領域之間。 次生代謝物在介導復雜的物種間相互作用和確保在競爭環境中生存方面發揮著重要作用。群體感應(QS)是由n-?；?高絲氨酸內酯或多肽等小分子誘導的，可以使細菌控制協同活性，使其表型適應生物環境，從而導致細胞-細胞粘附或生物膜形成。在大多數厭氧生態系統中，物種間直接電子傳遞(DIET)是一種重要的通訊機制。此外，揮發性化合物可以作為長距離跨領域通信的長期信使。此外，所謂的“真菌公路fungal highways”既是細菌的運輸系統，也是水和營養物質的運輸系統，因此在構建微生物網絡中可以發揮重要作用。 這些相互作用模式可能是正面的(互利、協同或偏利)、負面的(捕食、寄生、拮抗或競爭)或中性的。微生物的生命策略概念可以影響相互作用的結果。復雜微生物生態系統的穩定性取決于同一底物在不同濃度下的營養相互作用。 生物信息網絡和共現分析提供了有關微生物相互作用模式復雜性的觀點，但它們不適合闡明這些相互作用的性質。盡管存在這種局限性，微生物網絡的分析使研究人員能夠識別中心物種，并探索微生物群系內不同類型物種相互作用的潛力。 共現分析也可應用于不同的尺度，如群落尺度上的生態系統間共現模式、群落內共現微生物的模塊、嵌套在微生物群落內的模塊內的共現對。它們可能與定殖抗性有關，定殖抗性決定了外來微生物入侵本地群落的可能性。 微生物間的相互作用是微生物群落內進化和協同進化動力學的重要基礎。微生物群落成員之間的交流產生了一種復雜的格局，在這種格局中，細胞的適應性或功能不僅取決于單個細胞的遺傳潛力和化學環境，還取決于所感知的生物環境。 網絡中的樞紐物種通常被假設為關鍵物種，這一概念已從宏觀生態學轉移到微生物組研究。研究表明與其他物種相比，關鍵物種在不同物種間的相互作用中發揮關鍵作用，對生態系統的性能和動態具有更大的影響。然而，在一個聯合網絡中的樞紐物種不一定扮演一個關鍵物種的角色。Hub和keystone分類群確實需要更好地了解它們在原位的功能。 微生物相互作用可視化通過微生物共現網絡。微生物間的相互作用受環境因素的影響，可分為正相互作用、中性相互作用和負相互作用。微生物共現和共排斥網絡有助于可視化微生物相互作用。在這樣的網絡中，節點通常代表微生物類群，而邊緣則代表節點之間具有統計意義的關聯。綠色邊緣通常為正相互作用，而紅色邊緣則為微生物之間的負相互作用。相關模型系統的網絡分析所產生的假設進行檢驗是全面研究微生物相互作用的必要條件。 3.考慮微生物群的時空變化  微生物組內的時間動態可以從秒或分鐘的尺度進行評估，反映信使RNA的時間跨度到數百年或數千年的尺度，在此期間微生物與宿主或在特定環境中協同進化。細菌mRNA的半衰期取決于轉錄的基因，但通常在分鐘范圍內，而來自古菌基因的轉錄則更長，有報道稱其半衰期長達數小時。 盡管過去許多作者將微生物活性與rRNA含量聯系起來，但最近的研究表明這一概念存在嚴重的局限性，只有mRNA可以被認為是代謝狀態的可靠指標。 Stegen建議考慮三類因素作為影響微生物群落時間動態的因素:(i)生物和非生物歷史;(ii)內部動態;(iii)外部強迫因素。 大多數自然生態系統具有高度的空間結構特征，這被認為對許多生態系統服務具有重要意義?？紤]空間尺度可能意味著比較遙遠地區之間的微生物模式，以及同一生境存在不太明顯的區別。 土壤主要由微觀團聚體(< 0.25 mm)和宏觀團聚體(0.25至2 mm)組成，微觀團聚體結合土壤有機碳，使其免受侵蝕，宏觀團聚體限制氧氣擴散并調節水流;每種聚集體都提供了獨特的生態位，具有其特有的微生物組結構。 有人提出，土壤是地球上微生物群組成最多樣化的生態系統，這是在小空間尺度上存在很多的不同生態位的結果。例如，農業耕作方式導致的生態位減少可能導致微生物多樣性的損失。由于植物和耕作在很大程度上影響著土壤結構的發展，植物多樣性的喪失也強烈影響著土壤微生物群落的生物多樣性。然而，“有雞還是有蛋”這個問題的答案(土壤微生物群的變化是導致了植物多樣性的變化，還是相反?)仍然不清楚。 近年來，種子微生物群作為核心微生物群從一株植物世代向另一株植物世代垂直傳播的可能方式而受到關注。與植物相似，人體的微生物定植也不是單一的:每個身體部位都有自己的微生物群，甚至一個身體部位的微生物群也可能因取樣區域的不同而有所不同(如皮膚微生物群)。 微生物熱點地區和熱點時刻通常是緊密相連的。例如，土壤的特征是存在所謂的微生物熱點區域(空間分離，包括根際、旱作層或碎屑層)和熱點時間(時間動力學)。在熱點地區，活躍代謝微生物的比例是非熱點地區的2-20倍，這使得與微生物活性較低的地區相比，熱點地區微生物群落結構和功能的時間變化更具動態性。 熱點地區可參見之前文章：
微生物群落在時間和空間上的動態。 4.定義核心微生物群 基于共發生分析和微生物群落時空動態的實驗數據，可定義一個核心微生物群。確定核心微生物群可以促進對微生物群中穩定和永久成員的區分，而這些群體可能是間歇性的，只與特定的微生物群狀態有關，或局限于特定的環境條件。 第一個建議是由Shade和Handelsman提出，他們將核心微生物組定義為來自相似棲息地的微生物群落之間共有的成員，以在復雜的微生物組合中識別穩定、一致的成分。目前，核心微生物群的定義大多是基于DNA序列的分類學信息。 考慮到基于DNA分析(主要是標記基因的擴增子測序)的分辨率限制，很明顯核心微生物群落主要是通過種群的屬水平來定義的，而沒有考慮到菌株水平和功能變異。 相比之下，Lemanceau等人提出了一個功能核心微生物群，其中包括攜帶復制因子(基因)的微生物載體，這些微生物載體具有對整體適應度至關重要的功能。 微生物群隨著時間的推移而改變，這取決于環境條件、營養的可用性和/或生長和健康階段，甚至宿主的晝夜節律。相比之下，“核心”微生物群似乎保持相當穩定。 從功能預測到表現型
宿主-微生物共同進化 宿主與其相關微生物之間的密切關系產生了宿主及其相關微生物群共同進化理論。 一個例子是早期陸生植物的建立得到了共生真菌的促進，這表明自從微生物第一次出現在陸地上，植物就與微生物共同進化。另一個例子是真核生物本身;線粒體和質粒是真核細胞中的細胞器，它們是從共生細菌中衍生出來的，在整個共同進化過程中，它們完全依賴于宿主，反之亦然。 根據微生物與宿主的相互作用，將微生物劃分為有益的、致病性的和中性的。 近期對條件致病菌的研究表明，宿主與微生物的相互作用不僅取決于宿主本身，還取決于整個微生物組。 微生物與宿主相互作用的另一個有趣解釋是所謂的“安娜·卡列尼娜原理”。其與列夫·托爾斯泰的名言“所有幸福的家庭都是相似的;每個不幸的家庭各有各的不幸”相似。與健康的個體相比，營養不良的個體在微生物群落組成方面的差異更大。 這個概念之前介紹過，參見： Nature microbiology：微生物群落的安娜·卡列尼娜原則
宿主與其相關菌群之間的共同進化可以相應地被描述為拮抗或互惠。最近共進化理論轉向了整體方法。整體方法將宿主及其相關的微生物群視為一個整體，它們共同進化為一個實體。 微生物組研究技術標準 DNA提取和處理程序在隨后的微生物分析中會帶來偏差。使用已定義的模擬群落（ mock community）一方面可以幫助確定可能的最佳提取方法，另一方面可以作為一種內部控制來估計整個工作流和分析過程中可能存在的偏差。然而模擬群落并不能解決所有問題，這給環境樣本中微生物的分析帶來了偏差。 此外，在土壤等復雜環境中提取的DNA中，殘留DNA(來自死亡細胞的細胞外DNA以及活細胞的排泄DNA) 可能高達80%。這些殘留DNA可增加多樣性，并導致對分類單元相對豐度的不準確估計。 Nocker等人提出了一種可能的解決方案，他們使用了可穿透膜損傷細胞的popidium monoazide (PMA)，其中光誘導疊氮基團與DNA共價結合。這種交聯有效地抑制了革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌死亡細胞DNA的PCR擴增。該方法已成功應用于微生物組研究，特別是那些微生物豐度和活性較低的研究，但尚未成為標準。 Karst開發的無引物rRNA基因測序方法促進了微生物多樣性的發現。作者建議將poly(A)尾與和SSU rRNA分子逆轉錄結合成長讀長測序。利用這種方法，他們能夠高產出高質量的、全長的SSU rRNA序列，沒有引物偏差，并且在他們的研究中觀察到很大一部分至今未描述的多樣性。 ASVs在可重用性、可重復性和全面性方面都有很大的改進，因此ASVs可以取代OTUs成為標記基因分析和報告的標準單位。一些研究和聯合項目對不同的工具和管道進行了比較，結果顯示根據工具或管道以及所使用的參數，結果有顯著差異。除了足夠的測序深度，注釋數據庫的選擇對結果也有很大的影響。 稀有類群往往被忽略。這種罕見的類群占微生物總數的28%，在某些生境中扮演著重要角色，可能對構建群落具有重要意義。它們可能在生物地球化學循環中扮演著過度比例的角色，并且可能是微生物組功能的一個隱藏的驅動者。 計算資源仍然是生物信息學研究的瓶頸。例如TARA Oceans微生物組項目的原核生物分類包括135個樣本。這些樣本包括248個測序數據包，包含288億個讀長，數據量約10 TB。 微生物研究的未來展望和挑戰 隨著組學技術的進步，微生物組數據的可用性不斷增加，我們對微生物群提高生產力和多樣性系統可持續性的潛力的理解急劇增加。應用微生物組研究的宏偉愿景是改善人類、動物、植物和整個生態系統的健康。 一般而言，微生物群落的管理可以直接通過(i)微生物組移植，(ii)具有有益特性的微生物， (iii)微生物活性代謝物進行，或通過改變環境條件間接進行。 當比較基于微生物的人類、動物和種植系統的應用時，可以看到顯著的協同作用。雖然各個領域之間的聯系還不是很好，但在所有領域都出現了一種明顯的一致趨勢。 即并非所有個體宿主及其相關的本地微生物群落對特定引入的微生物、微生物組移植或代謝物的反應都是相同的。相反，它依賴于對那些特定的寄主-微生物、環境-微生物以及微生物-微生物相互作用的基本理解，這些相互作用介導了微生物組在不同環境中的組合和功能能力。 人體微生物組正在成為個體化藥物的關鍵靶點。糞便菌群移植是美國批準的治療難治性梭狀芽孢桿菌復發感染的方法。盡管其功效背后的機制仍不為人所知，但近年來其應用范圍迅速擴展到胃腸道疾病以外的多個領域，如肥胖癥、代謝綜合征和肝臟疾病的潛在療法。人類之間以及跨越時空梯度的微生物異質性需要多維數據集和一套統一的理論和統計工具來分析人體微生物組，并充分發揮微生物治療的潛力?？偟膩碚f，最近所述的腸-腦、腸-肝和腸-肺軸也強調了健康腸道菌群的重要性，使腸道成為人類健康的中樞器官。 植物微生物組被確定為下一次綠色革命的關鍵。一種將植物育種、精細耕作、農業管理和微生物組研究相結合的系統方法，為在不斷變化的世界中提高可持續的作物生產提供了一種強有力的策略。 特定物種和生境的植物微生物群對植物的功能起著多方面的作用，如(i)種子萌發和生長，(ii)營養供應，(iii)對生物和非生物脅迫因子的抗性，(iv)產生生物活性代謝物。由于植物微生物對作物健康的重要性，人們對其進行了長期的研究。此外，還制定了一份廣泛的微生物組管理策略和產品清單，其中包括i)微生物組移植(秸稈糞便和生物動力學添加劑)，(ii)微生物接種劑，(iii)微生物和植物提取物，(iv)改變環境條件的方法。 與人類腸道菌群相似，種子/根際菌群對植物至關重要，種子是下一代微生物的完美目標。 Perez-Jaramillo提出了針對種子的“回歸根部”方法，利用農作物野生親緣的種子微生物群落，或利用有前途的生物資源，有可能使植物與其特定的種子微生物群之間形成匹配的共生關系。收獲后的微生物群與我們的食品微生物群密切相關，這些微生物群也可以被管理為所需的食品功能特性、安全和保存問題、感官或健康特性。
結論 基于該領域最近的進展，建議恢復由Whipps等人提出的微生物組術語的最初定義。這個定義包含了在1988年出版后30年仍然有效的所有重要要點，并通過兩句解釋性的句子加以擴展，區分術語微生物組和微生物群，并闡明其動態特性。 微生物組被定義為一個具有獨特的物理化學性質的特征微生物群落，它占據一個合理的明確定義的棲息地。微生物組不僅是指所涉及的微生物，還包括它們的活動場所，從而形成特定的生態位。微生物組是包括真核宿主在內的宏觀生態系統的一部分，它形成了一個動態的、相互作用的微生態系統，易于隨時間和規模變化，對真核宿主的功能和健康至關重要。 微生物群是由屬于不同生物界的微生物組合而成的(原核生物[細菌，古菌]，真核生物[原生動物，真菌，藻類])。而“它們的活動場所”包括微生物結構、代謝物、可移動的遺傳元素(例如轉座子、噬菌體和病毒)，以及嵌入在棲息地環境條件中的殘留物DNA。 此外，作者認為以下幾點對微生物組研究至關重要: 1.核心微生物群是一組來自相似棲息地的微生物群落共享的成員，這對于理解復雜微生物組合的穩定性、可塑性和功能非常重要。 2.適應于宏觀生態學的理論可能有助于理解不同環境下的微生物群落動力學模式，但它們的普遍應用還有待驗證。 3.適當的實驗、方法和統計設計是每個微生物組研究的基礎。空間、時間和發展應該在設計中實現集成(i)選擇合適的采樣頻率,以獲取完整的核心和瞬態微生物群,(ii)考慮適當的空間系統的規模,和(3)強烈的動態系統,調查微生物分布的時空連續體。 4.微生物組的研究受到方法學進步的強烈推動。盡管在這一領域取得了所有進展，但沒有一種完美和普遍的方法。一個技術工具箱將減少由單個技術產生的偏見，并使生物系統作為一個整體得到更完整的研究。 5.微生物在生態系統中起著重要的作用。建議在微生物組研究中結合幾種目前可用的方法，以便更深入地了解微生物的功能。 6.盡管在過去的十年中產生了大量的組學數據，我們仍然缺乏關于生物體背后的信息。因此需要大力實施更多以培養為基礎的方法來進行微生物組研究，從而能夠描述特定微生物群對其環境的生態型和適應模式。 7.微生物相互作用是微生物群落功能和進化動力學的基礎。因此提倡在研究設計中考慮交互作用。 8.宿主與微生物的相互作用形成了互惠的適應度、表型和代謝，從而提出了微生物群及其宿主共同進化的理論。建議一種基于全基因組進化理論的整體方法。 9.根據微生物與宿主的相互作用，將微生物分為有益微生物、致病微生物和中性微生物是基于人類中心的觀點。事實上，宿主和整個微生物組的生理機能在很大程度上影響著相互作用的結果。 |
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