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（一）培養(yǎng)基 1.概念：講解培養(yǎng)基概念：由人工方法配制而成的，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。 2.種類
3.成分 （1）基本成分
（2）特殊成分和條件 培養(yǎng)基還需要滿足不同微生物生長(zhǎng)對(duì)PH、氧氣、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求：如乳酸桿菌時(shí) 需要添加維生素 ，霉菌需要將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為酸性 ，細(xì)菌時(shí)需要將pH調(diào)節(jié)為中性或微堿性 。 （二）無菌技術(shù) 1.主要方面 （1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行 清潔和消毒 ； （2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌 ； （3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在 酒精燈火焰附近 旁進(jìn)行； （4）避免已滅菌處理的材料用具與 周圍物品相接觸。 2.消毒與滅菌的比較
3.常用的消毒與滅菌的方法 （1）消毒方法： ①日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法； ②對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用巴氏消毒法（作簡(jiǎn)要介紹）； ③對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸 或煤酚皂 等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒。 ④實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒； ⑤飲水水源用氯氣進(jìn)行消毒。 （2）滅菌方法： ①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法； ②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱 ； ③培養(yǎng)基、無菌水等使用 高壓蒸汽滅菌法，所用器械是 高壓蒸汽滅菌鍋 。 ④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。 （一 ）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 1.計(jì)算：根據(jù)配方比例，計(jì)算100mL培養(yǎng)基各成分用量。 2.稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。稱取牛肉膏和蛋白胨時(shí)動(dòng)作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空氣中水分。 3.溶化：①加水加熱熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化鈉繼續(xù)加熱；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100mL。整個(gè)過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。 4.調(diào)pH：用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。 5.滅菌：將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加塞包扎后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌；所用培養(yǎng)皿用報(bào)紙包扎后用干熱滅菌箱滅菌。 6.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。 倒平板的方法及注意事項(xiàng)： ①火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞； ②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰； ③左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。 ④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。 （二）純化大腸桿菌 1.平板劃線法 （1）定義和目的 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落。分離后，一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落，這是消除污染雜菌的通用方法，也是用于篩選菌株的最簡(jiǎn)便方法之一。 （2）操作步驟 ①將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒直至燒紅。 ②在酒精燈火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開大腸桿菌的菌種試管的棉塞。 ③將菌種試管口通過火焰達(dá)到消滅試管口雜菌的目的。 ④將冷卻的接種環(huán)伸入到菌液中取出一環(huán)菌種。 ⑤將菌種試管口再次通過火焰后塞上棉塞。 ⑥將皿蓋打開一條縫隙，把接種環(huán)伸入平板內(nèi)劃3～5條平行線，蓋上皿蓋，不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。 ⑦灼燒接種環(huán)，冷卻后從第一區(qū)劃線末端開始向第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)上述過程，完成三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將第五區(qū)的 劃線與第一區(qū)劃線相連。 ⑧將平板倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2.稀釋涂布平板法 （1）定義和目的 將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分 別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀釋倍數(shù)足夠高時(shí)，即可獲得單個(gè)細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌 落。 （2）操作步驟 系列稀釋操作 ①取盛有9mL水的無菌試管6支，編號(hào)101、102、103、104、105、106。 ②用灼燒冷卻的移液管吸取1mL菌液注入編號(hào)為101試管中，并吹吸3次，使之混勻。 ③從101倍液中吸取1mL菌液注入到編號(hào)為102試管內(nèi)吹打均勻，獲得102倍液。依此類推。 注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時(shí)，試 管口和移液管離火焰1~2cm處。 涂布平板操作 |
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