B.胞內細胞因子和細胞表面抗原的多色染色方案
一，收獲細胞
可以從體內刺激的組織或體外培養物刺激制備活的活化細胞群?？梢詫⒓毎麘腋〔⒎峙涞剿芰瞎芑蛭⒖装逯杏糜诿庖邿晒馊旧?。在染色和儲存過程中應保護細胞免受光照。
二，阻斷Fc受體
阻斷Fc受體的試劑可用于減少非特異性免疫熒光染色。
小鼠Fc受體阻斷：針對FcgII/III受體的純化的2.4G2抗體(Fc Block?)可用于阻斷由Fc受體介導的熒光抗體的非特異性染色。為了用小鼠Fc Block阻斷小鼠Fc受體，將預孵育的細胞懸浮液與1μg Fc Block/10e6個細胞在100μl染色緩沖液中，4℃孵育15分鐘。然后再用特異性熒光抗體染色細胞。
人Fc受體阻斷：可以通過將細胞與來自相同物種的過量無關純化的Ig，或使用和免疫熒光染色的抗體相同亞型的純化抗體共孵育，或通過與PBS中的10％FCS預孵育來阻斷Fc受體。
大鼠Fc受體阻斷：針對FcgII受體的D34-485純化抗體(Rat Fc Block?）可用于阻斷由受體介導的熒光抗體的非特異性染色。將細胞懸浮液與1μg Fc Block?/10e6個細胞在100μl染色緩沖液中，4℃孵育15分鐘，以阻斷大鼠Fc受體。然后再用特異性熒光抗體染色細胞。
三，染色細胞表面抗原
預先滴定的最佳濃度（≤0.5μg）的細胞表面抗原特異性單克隆熒光抗體，和~10e6個細胞在50μl染色緩沖液（100μl用于管中染色）中，4℃共孵育15-30分鐘。例如， CD3，CD4，CD8，CD14或CD19。改變程序以使細胞在細胞表面抗原染色之前被固定需要根據經驗鑒定合適的抗體克隆。
注意：一些識別細胞表面天然標志物的抗體可能不會與固定/變性后抗原結合。出于這個原因，建議在固定/透化和胞內細胞因子染色之前，用活的、未固定的細胞進行細胞表面抗原的染色。
用染色緩沖液洗滌細胞2次（1ml /洗滌，管中染色），離心沉淀（250×g），并除去上清液。
四，固定和透化細胞
重懸細胞于100μl（250μl，管中染色）Cytofix/Cytoperm?溶液中，4℃ 10-20分鐘。
注意：在添加Cytofix/Cytoperm?溶液之前，可以通過渦旋來避免細胞聚集，使細胞混勻徹底。
在1X Perm/Wash?溶液中洗滌細胞兩次（1ml /洗滌，管中染色），沉淀并除去上清液。
注意：在洗滌步驟中需要Perm/Wash?溶液以使細胞保持透化狀態。
四‘，替代固定和透化方法
可以固定和儲存細胞以在稍后的時間繼續細胞內染色。
·細胞的固定和儲存
在4℃下將細胞重懸于100μl（250μl用于管或1 ml/10e7細胞用于大量細胞固定）4％多聚甲醛溶液中10-20分鐘。
在染色緩沖液中洗滌細胞2次。
將細胞重懸于染色緩沖液中4℃保存或90% FCS/10% DMSO中-80℃儲存。
·透化固定的細胞
對于冷凍細胞，洗滌2次以除去DMSO。
將細胞重懸于Perm/Wash?中15分鐘。
離心沉淀。
五，細胞內細胞因子染色
在50 μl Perm/Wash?溶液（100μl用于管中染色）中徹底重懸固定/透化細胞，溶液中預加有最佳濃度的熒光標記細胞因子抗體或適當的陰性對照。4°C避光孵育30分鐘。
用1X Perm/Wash?溶液洗滌細胞2次（1ml /洗滌以在管中染色）并在流式細胞術分析之前重懸于染色緩沖液中。
對于大多數細胞因子，細胞可以留在染色緩沖液中，第二天進行分析。在分析之前延長放置時間可能會導致熒光信號的減弱。
C.全血樣本活化和細胞內染色技術方案
用RPMI1640培養基稀釋全血1：1體積（例如100μl：100μl）并充分混合。
在蛋白質轉運抑制劑如含brefeldin A的GolgiPlug?或含monensin的 GolgiStop?存在下，將細胞活化劑或促分裂原加入稀釋的血液中，例如50 ng/ml PMA + 1 μg/ml calcium ionophore A23187或 PMA + 1 μM ionomycin (終濃度)。
短暫渦旋混合。將200μl等分至12×75mm塑料管中。在37℃下在5％CO2中孵育4-6小時。
加入2ml 紅細胞裂解液，渦旋，在室溫下避光孵育10分鐘。
離心5分鐘，500×g。
吸出上清液。在染色緩沖液中洗1次。以500×g離心5分鐘。吸出上清液。
繼續執行上述一般方法B部分的步驟3-5。
D.流式細胞分析
使用細胞表面染色對照管設置PMT電壓和補償。根據阻斷對照，同型對照或未染色細胞設置陰陽性界限標記。
存在于活化的人PBMC培養物中的細胞因子產生細胞的頻率可以由于供體變異性而廣泛變化。因此，來自單個供體的冷凍保存的細胞可用于縱向研究。
為了進行適當的流式細胞分析，應通過光學顯微鏡和/或流式散射光圖檢查通過該方法染色的細胞，以確認它們分散良好。為了進行統計學上準確的各群體分析，應收集足夠多Events的細胞信息?？梢栽跀祿俜治鰰r生成雙變量點圖或等高線圖，以顯示各個細胞共表達某些水平的細胞表面抗原和細胞內細胞因子蛋白的頻率和模式。
E.染色對照
1.陽性染色對照
抗細胞因子熒光抗體的TDS描述了體外陽性培養系統，可在特定時間點誘導可檢測頻率的細胞因子產生細胞。通過這些方法刺激的細胞可用作實驗系統的陽性對照。已發表的免疫熒光染色報告和ELISPOT分析也可提供有關產生細胞因子產生細胞的不同實驗方案的有用信息。
PharMingen提供的細胞內細胞因子陽性對照細胞，一組活化和固定的白細胞群，已經過細胞因子產生的篩選。
2.陰性對照
以下三種對照之一可用于區分特異性染色與人為染色。研究人員應選擇哪種對照最符合他們的研究需求。
·同型對照：和特異性抗體相匹配的同亞型對照染色。
將細胞沉淀重懸于50 μl Perm/Wash?溶液（100μl用于管中染色），其含有抗細胞因子抗體相同濃度的同型對照抗體(< 0.5 μg/10e6 細胞)。
4°C孵育15-30分鐘。
使用上述用于細胞內染色的程序洗滌細胞。
·配體阻斷對照：用重組細胞因子預阻斷抗細胞因子抗體。
將熒光抗體與適當稀釋的細胞因子在體積≥ 50 μl 的 Perm/Wash?溶液中于4°C預孵育30分鐘。
用預封閉的熒光標記的抗細胞因子抗體（在Perm/Wash?溶液中）以50μl（100μl用于管中染色）重懸固定/透化細胞，并在4℃下孵育30分鐘。
使用上述用于細胞內染色的程序洗滌細胞。
·抗體阻斷對照：用沒有標記熒光染料的抗體預孵育細胞。
將固定/透化細胞重懸于25μlPerm/ Wash?溶液（50μl用于管中染色），其中含有未綴合的抗細胞因子抗體（與綴合抗體相同的克?。┫♂屩吝m當濃度（>5μg/ 10e6細胞） ，在4°C下孵育30分鐘。
孵育后，在25 μl Perm/Wash?緩沖液（50μl用于管中染色）中加入熒光抗細胞因子抗體，最終體積為50μl用于微孔板或100μl管中，4°C孵育30分鐘，染色。
使用上述用于細胞內染色的程序洗滌細胞。
染色緩沖液
