【原】文獻精讀：地下微生物網絡變化與橄欖黃萎病不同耐受水平之間的聯系

地下微生物網絡變化與橄欖黃萎病不同耐受水平之間的聯系

Linking belowground microbial network changes to different tolerance level towards Verticillium wilt of olive

譯者：五谷雜糧

Microbiome [IF：10.13] 2020-02-01  Articles doi: https:///10.1186/s40168-020-0787-2全文可開放獲取 https://microbiomejournal./articles/10.1186/s40168-020-0787-2第一作者：Antonio J. Fernández-González 和 Martina Cardoni 其他作者：Carmen Gómez-Lama Cabanás² , Antonio Valverde-Corredor2² ,Pablo J. Villadas1¹ , Manuel Fernández-López¹ 通訊作者：Jesús Mercado-Blanco² jesus.mercado@ias.csic.es

主要作者單位：¹ Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos, Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Calle Profesor Albareda 1, 18008 Granada, Spain.² Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Campus ‘Alameda del Obispo’ s/n, Avd. Menéndez Pidal s/n, 14004 Córdoba, Spain

摘要：

Background【背景】橄欖黃萎病（VWO）是由土傳真菌病原菌Verticillium dahliae（黃萎病）引起的。采用耐/抗病的橄欖品種是管理VWO的最佳措施之一。對橄欖相關的微生物菌群及其與生物耐受性潛在關系的了解幾乎為零。本工作的目的：（1）描述兩個橄欖品種（耐受（Frantoio）和易感（Picual）VWO）的地下（根內和根際）微生物群落的結構、功能和共生相互作用；（2）評估這些群落能否解釋不同疾黃萎病感染水平間的差異。【結果】無論是否接種了V. dahliae，兩個橄欖品種與根相關菌群的α和β多樣性間僅有微小差異。然而，未接種V. dahliae的植物群落在分類學組成上存在顯著差異，Frantoio品種的相關有益微生物豐度較高，而Picual品種的的潛在有害微生物豐度較高。接種V. dahliae后，Picual在分類學水平上有顯著變化， 并且菌群的互作網絡，正負相關數量等也發生的巨大的改變。在根內，Frantoio群落向高連接度和低模塊化網絡轉變，Picual群落則表現出截然不同的行為。在根際，V. dahliae僅出現在Picual的微生物網絡。【結論】兩個橄欖品種的地下微生物群落非常相似，病原菌的引入并沒有引起其結構和功能的顯著改變；而在接種V. dahliae后，它們的網絡產生了顯著差異。這種現象在根內群落中更為明顯。因此，發現了該微生境的微生物網絡的與對土傳病原體的的敏感性/耐受性之間的相關性。此外，V. dahliae入侵Picual的微生物網絡表明，接種對Picual的地下微生物群落有更大的影響。結果表明，共現相互作用的變化可能解釋（至少部分解釋）供試橄欖品種的VWO敏感性差異。【關鍵詞】微生物功能群落，微生物結構群落，橄欖，根際，根內，Verticillium dahliae，抗病性，共現網絡

背景

橄欖（Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea）是全球溫帶地區最重要的林木作物之一。它構成了與南歐（西班牙、希臘和意大利為主要生產國）緊密相關的農業生態系統，該地區集中了全球61.8％的橄欖產量，其次是非洲（17.9％）、亞洲（16.9）及美洲（2.8％）[1]。但是，一些傳統的和新出現的病原體可能危及作為戰略商品的橄欖種植的未來，特別是在地中海盆地。橄欖黃萎病(VWO)，由土傳真菌Verticillium dahliae Kleb.引起，被認為是許多橄欖種植地區最具破壞性的疾病之一[2]。此外，由于多種原因（在其他地方得到全面和嚴格的審查），這種疾病很難控制[2，3]。在其他流行病學因素中，VWO攻擊的嚴重程度取決于感染該樹的V. dahliae的毒力。傳統上，感染橄欖的V. dahliae菌株分為落葉型（D）和非落葉型（ND）兩種致病型。D型病原體(1A譜系)具有高毒性，通常會引起嚴重的萎蔫綜合征，包括萎黃病、綠葉脫落(落葉)和樹木死亡。總體而言，D型菌株比ND型菌株的毒力更強，D型代表菌株會嚴重影響耐ND型菌種的橄欖品種。因此，在許多橄欖栽培地區當前的植物病理學情況下，建議實施VWO的綜合管理策略，因為沒有任何一種單一的控制措施在單獨應用時是有效的。

使用耐/抗橄欖品種被認為是最有效的控制手段之一。確實，種植有耐性的或野生的橄欖品種(O. europaea subsp. europaea var. sylvestris Brot.)（與易感品種相比，可以抵抗V. dahliae感染而不出現嚴重的疾病癥狀），可以在育種計劃中替代死樹作為砧木或VWO抗性來源。不幸的是，迄今為止，還沒有橄欖品種對VWO具有完全抗性的報道。對VWO的耐/抗性研究主要集中在對V. dahliae有不同抗性的橄欖品種的生化、生理或遺傳和完整轉錄組上。雖然已經對橄欖相關微生物菌群的特定有益成分進行了研究，但其中一些旨在分離和表征針對VWO的生防劑（BCA），只有很少的例子研究整個土著橄欖的微生物菌群及其與生物約束敏感性的潛在關系。最近，我們描述了在相同的氣候、農學和土壤條件下，在沒有V. dahliae壓力的情況下，來自不同地理區域的橄欖品種的地下微生物群落。與植物相關的微生物群落是決定植物健康和生產力的關鍵因素之一，它們有助于養分的利用和吸收、增強抗逆性、提供抗病性，促進生物多樣性。有趣的是，某些植物在不同的土壤中生長時具有相似的群落，而同一物種的不同基因型或品種可以擁有不同的根系微生物群落，這表明植物基因型對其根相關微生物群落的組成至關重要。植物選擇并塑造地下微生物群落，通過一系列機制刺激或抑制土著微生物菌落的某些成員，這些成員可以作為抵抗土傳病原體的第一道防線。根系相關微生物群落的結構、組成和功能不僅受寄主植物基因型、適應性和物候學的影響，而且還受土壤健康的影響。例如，最近發現健康煙草土壤的細菌和真菌群落與青枯病（Ralstonia solanacearum）侵染的土壤有很大不同，從而得出以下假設：健康土壤具有較高的有益微生物豐度，從而改善土壤養分，促進植物生長，并控制土壤傳播疾病。

微生物群落很復雜，由許多可能相互作用的類群組成。因此，微生物群落的功能并不等于其各個組分的總和。在這些群落中，微生物可以參與各種各樣的關系：積極的（例如，合作生成生物膜，使其成員產生抗生素耐藥性），消極的（例如，抗生作用或對資源的競爭），或中性的。對微生物之間建立的關聯進行深入分析，可能有助于確定其環境生態位，揭示其在群落中的功能，確定生態系統的功能/穩定性。網絡分析是研究一組項目(如微生物)的數學、統計和結構特性及其之間的聯系的有用工具。最近，一種基于評價類群間共生關系的新方法，強調了正負生物學關系，最近被用于研究從人類腸道到海洋和土壤等復雜環境中微生物之間的共生模式。共生模式無處不在，可能是由具有相似或互補功能的物種或基因造成的，也可能是由微生物物種共存的共同環境條件造成的。生物信息網絡和共現分析為我們提供了一個關于微生物相互作用模式復雜性的概念，但它們并不適合揭示這些相互作用的本質。盡管有這樣的局限性，微生物網絡的分析仍然是進行假設的重要工具。然而，特定類型微生物相互作用的存在及其對種群動態或功能的影響需要在相關的模型系統中進行驗證。此外，技術手段，如采用穩定同位素進行實驗，或熒光原位雜交，以及共聚焦激光掃描顯微鏡（FISH-CLSM）與雙重培養測定法相結合，對于驗證這些假設非常有用。

對表現出不同VWO反應的橄欖樹品種的根相關菌群的結構、組成、功能和動力學的準確了解，有助于了解這些微生物群落是否以及在多大程度上有助于宿主對V. dahliae的耐受性/敏感性。此外，根據這一基本信息，可以在綜合疾病管理框架內設想并開發更有效、更全面的VWO控制方法，如：基于微生物的生物控制策略；或鑒于耐藥品種的相關微生物區系進行抗病育種。因此，這項工作的主要目標是：（1）描述與橄欖品種Frantoio（耐VWO）和Picual（易感VWO）相關的地下（根內和根際）微生物群落的結構(DNA水平)和功能(RNA水平)；（2）接種D型V. dahliae（高毒）后，評估兩個橄欖品種相關微生物群落在組成和活性方面的變化；（3）通過網絡分析，評估在V. dahliae存在下，兩個橄欖品種的根內和根際微生物相互作用可能的差異變化。待測試的假設是：（1）橄欖品種的VWO耐受水平與其根微生物群的組成、結構、功能（潛在活性微生物[33]）方面的差異有關；（2）V. dahliae的存在改變并重組了橄欖根微生物網絡，這可能有助于解釋橄欖品種對VWO的耐性水平。

結果

Results

測序數據的一般特描述

General characteristics of sequencing datasets

通過對所有樣本進行高通量測序，共獲得了7,749,457個(細菌)和6,919,278個(真菌)原始reads。聚類后，最終僅保留了4189,961(細菌)和4829,128(真菌)的高質量reads。為避免對多樣性的高估，舍棄了小于0.005％高質量reads的OUT（操作分類單元）。因此，最終得到1437個細菌OTU和504個真菌OTU。為比較α多樣性，分別對每個域（細菌和真菌）、每種核酸（DNA和RNA）和每個區室（根際和根內）的最小樣本進行稀疏處理。最后，448個樣本中的443個OTU（表S1）（Good’s coverage覆蓋率> 96.64%）被保留用于下游分析。【接種Verticillium dahliae之前，“Picual”和“Frantoio”的地下微生物群落解析】 比較兩個微生境（根內和根際）的豐度（可觀察的OTUs）和逆辛普森（InvSimpson）α多樣性指數，結果顯示根際數據集高于根內。對α多樣性指數的Kruskal-Wallis檢驗表明，細菌群落之間存在顯著差異，而真菌群落之間無顯著差異(表1)。比較來自相同微生境（根內和根際）、但不同群落（結構[DNA]和功能[RNA]）的數據集發現，除了根內微生物群落（細菌和真菌）之間的α多樣性指數比較外，在大多數病例中都發現了顯著差異。對于所檢測的橄欖品種(Picual和Frantoio)，除了Picual植株的功能性(RNA)根際細菌群落的豐富度和多樣性顯著增加外，其他方面均無差異(表1)。在實驗過程中，對每個數據集進行比較時，還發現了一些差異。然而，在每個時間點比較樣本時，沒有發現品種之間的差異(數據未顯示)。關于β多樣性并聚焦微生物群落動態（即OTU相對豐度隨時間的變化），主要區別僅在于初始時間（T0）和分析的其余時間點（8、15和30天）之間，而與品種、微生境、核酸或微生物域無關。唯一的例外是Frantoio植株的結構(DNA)根內群落 (表2)。此外，比較兩個品種在不同時間點的細菌群落時，幾乎無差異。相反，Picual和Frantoio植株的根內真菌群落之間有顯著差異。這種差異隨時間保持不變(表2)。根內細菌群落以Actinobacteria（放線菌）、Proteobacteria（變形菌）和Bacteroidetes（擬桿菌）為主(占序列的74% ~ 97%；圖1a，b）。有趣的是，Picual的結構(DNA)和功能(RNA)群落中Candidatus Saccharibacteria的相對豐度均顯著高于Frantoio (p值< 0.01)。該門在功能（RNA）群落中的相對豐度較低，在“其他”群落中也有分布(圖1b)。相反，與Picual相比，Frantoio的功能（RNA）群落中Proteobacteria和Verrucomicrobia的相對豐度顯著較高(p值分別為0.007和0.02)。在細菌群落動態中發現了一些差異，但通常不一致（不超過一個時間點），或者隨時間變化趨勢不明顯（數據未顯示）。根內真菌群落的優勢門為Ascomycota（子囊菌門）, Glomeromycota（球囊菌門）和 Basidiomycota（擔子菌門）(所有樣本中序列均>90%；圖1c, d)。在任何采樣時間點，均未發現品種間的差異。然而，Basidiomycota（擔子菌門）的減少伴隨著Glomeromycota（球囊菌門）的增加(圖1d)，盡管這種趨勢在任何一個門上都沒有統計學意義。此外，在比較結構(DNA)和功能(RNA)群落時，Ascomycota（子囊菌門）和Glomeromycota（球囊菌門）的患病率呈倒排分布(圖1c)。根際細菌群落的優勢門為Proteobacteria（變形菌門）和Acidobacteria（酸桿菌門），其次為Bacteroidetes（擬桿菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）和Gemmatimonadetes（芽單胞菌門），占序列的88%以上（圖2a，b）。與根內樣本相似，Picual的結構（DNA）和功能（RNA）群落中的Candidatus Saccharibacteria均明顯高于Frantoio（(p < 0.03）。此外，Frantoio的功能（RNA）群落中Proteobacteria（變形菌門）的豐度顯著高于Picual（(p = 0.027）。就真菌群落而言，在結構（DNA）和功能（RNA）群落中，Ascomycota（子囊菌門）都是優勢門。同樣，在根內群落中，Glomeromycota（球囊菌門）在功能（RNA）群落中的豐度高于結構（DNA）群落。然而，平均起來，該門在這個微生境中的豐度并未超過Ascomycota（子囊菌門）（圖2c，d）。當比較兩個品種的功能（RNA）群落時發現，Picual中僅Chytridiomycota（壺菌門）的豐度顯著高于Frantoio（(p = 0.042）（圖2d）。

表1 α多樣性指數的p值揭示了溫室栽培的橄欖品種中特定微生境細菌群落的顯著差異

表2 定量β多樣性指數的PERMANOVAs表明，橄欖品種和處理之間存在相似的微生物群落

接種 D型 Verticillium dahlia后， “Picual” 和 “Frantoio” 的地下微生物群落的變化

Unraveling the belowground microbiota of “Picual” and “Frantoio” prior to the inoculation with Verticillium dahliae

當比較未接種（對照）與接種V. dahliae的數據集（每個品種在每個微生境和每個核酸中）時，未檢測到α多樣性指數的差異。唯一的例外是接種V. dahliae后Frantoio根內功能（RNA）細菌群落的豐度下降。對棲息于該品種根內的結構（DNA）真菌群落中也觀察到了同樣的結果（表1）。關于β多樣性，在接種V. dahliae后，根內微生物群落沒有發現差異（表2）。該比較僅顯示Frantoio在T15（接種15天后；dai）的根際微生物群落中有顯著差異（成對Adonis p < 0.001），而在Picual中卻沒有。必須強調的是，由于在群落動態中僅觀察到不一致和微小的變化（見上一節），因此本研究用三個采樣時間點（T8、T15和T30 dai）的平均值對兩個品種的未接種和接種V. dahliae的植物的微生物譜進行了比較。關于根內細菌群落，當比較未接種和接種V. dahliae的樣品時，只有Frantoio的Actinobacteria（放線菌門）和Picual的 Acidobacteria（酸桿菌門，包括其他細菌，圖1a）的相對豐度有顯著差異（前者p = 0.007，后者p = 0.028）。僅在結構（DNA）群落中觀察到這種差異。接種V. dahliae后，真菌群落無顯著變化。接種V. dahliae后，Frantoio根際細菌群落中有兩個小門（DNA中的Latecibacteria和RNA中的Candidate division WPS-1）受到影響（數據未顯示）。相比之下，Picual根際（結構（DNA）群落） 中6個門顯著改變，接種病原菌后，除Proteobacteria（變形菌）外，其他門均減少（附件2：圖S1）。關于真菌群落，接種V. dahliae后，Frantoio根際結構（DNA）真菌群落無顯著變化，但次要門Mucoromycota有所減少（數據未顯示）。與此相反，當接種V. dahliae后，Picual的主要門Glomeromycota（球囊菌門）在結構（DNA）和功能（RNA）群落中均有所下降（(p < 0.03）（圖2c, d）。確實，在Glomeromycota（球囊菌門）中序列（叢枝菌根真菌，AMF）中84.6％被歸類為科水平，它們都屬于Glomeraceae（球囊菌科）。有趣的是，在比較該門的根內/根際比率時，與未接種植株計算出的比率（結構群落2.33和功能群落0.98）相比，接種V. dahliae后Picual的根內/根際比急劇上升（結構群落6.33和功能群落2.73）。相比之下，在Frantoio樣品中，該比率的增加明顯更溫和（結構群落從對照組的1.70增加到接種病原菌組的3.01，功能群落從對照組的1.18增加到接種病原菌組的1.54）（圖1c, d和2c, d）。【橄欖地下群落在屬水平上的細微變化】 超過63%的細菌序列被歸類為屬水平（對根內而言> 74%），180~188個不同的屬（附件3：表S2）。最終，83個根內屬和143個根際屬被認為是Picual / Frantoio核心細菌組的一部分，其占分類序列的98％以上。未接種和接種了V. dahliae的植物的核心細菌組共享100%的屬（附件4：表S3）。在未接種的植物中，兩個品種的根內結構（DNA）和功能（RNA）群落分別在20個屬和32個屬的相對豐度（4個時間點T0、T8、T15和T30的平均值，）上有顯著差異（(p < 0.05）。值得注意的是，在兩個群落（結構和功能）中，Picual中的Cellvibrio（纖維弧菌屬）豐度較高，Frantoio中的Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌屬）、Pseudonocardia（假諾卡氏菌屬）、Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）、Legionella（軍團菌屬）和 Rhodanobacter（羅河桿菌屬）豐度較高。其余屬僅在這些群落（如：Saccharothrix（糖絲菌屬）、Mycobacterium（分支桿菌屬）、Streptomyces（鏈霉菌屬）和Flavobacterium（黃桿菌屬））中的一個屬中有顯著差異，或相對豐度較低（小于0.2%；附件5：圖S2a, b）。與未接種植物相比，接種V. dahliae后，Frantoio根內結構(DNA)群落中豐度非常低的Streptomyces（鏈霉菌屬）和其他16個屬豐度降低（附件6：圖S3a）。相比之下，接種病原菌后，該品種的Steroidobacter和Ohtaekwnagia增加。在Picual植物中，接種后Gp10和Rhodanobacter（羅河桿菌屬）下降，而Cellvibrio（纖維弧菌屬）增加（附件6：圖S3b）。根際變化少于根內對照（即：Picual和Frantoio植物在結構群落中有5個屬，在功能群落中有9個屬）（附件7：圖S4）。在根際，接種病原菌只影響了Frantoio植物中的少數次要屬（相對豐度＜0.2%）。此外，這些屬在結構和功能群落之間是不同的（附件8：圖S5a，b）。除了主要屬Gp4外，在Picual植物中觀察到了類似的模式，接種V. dahliae后結構群落降低（附件8：圖S5c，d）。關于真菌群落，33% ~ 50%的序列被歸類為屬水平（105~129個不同的屬；附件9：表S4）。只有17個（根際）屬和37個（根內）屬被認為是Picual和Frantoio核心菌群中共有的部分，占分類序列的79%以上。至于核心菌群，100%的核心真菌屬在未接種和接種V. dahliae的植物中共有，但現在已成為接種植物根際核心菌群的主要屬之一的Verticillium屬除外（附件10：表S5）。在根內，比較兩個橄欖品種的未接種植物時，只有8個（結構群落）和6個（功能群落）屬顯著不同（附件11：圖S6a，b）。Picual對照植物的結構（DNA）和功能（RNA）群落中Macrophomina（殼球孢屬）和Fusarium（鐮刀菌屬）豐度較高，而Frantoio中Acremonium（枝頂孢屬） 和Lepidosphaeria豐度較高。此外，在Picual結構群落中，Lophiostoma和 Rhizoctonia（絲核菌屬）豐度較高，而Frantoio中Ilyonectrya豐度較高。有趣的是，在任何取樣時間點均未在接種病原菌植物的根內發現Verticillium（輪枝菌屬）。綜上，接種V. dahliae后沒有觀察到該微生境的變化。在根際，在結構群落和功能群落中，Frantoio的Acremonium（枝頂孢屬）、Lepidosphaeria和Ilyonectria再次出現，伴隨著Chaetomium（毛殼菌屬）和Cirrenalia（海卷孢屬），豐度顯著高于未接種的Picual（p < 0.05）。相比之下，Picual中只有Lecanicillium、Plectosphaerella和Setophaeosphaeria的相對豐度顯著高于Frantoio（附件12：圖S7a b）。在接種病原菌后，伴隨著Verticillium的入侵，Frantoio植物根際中Gemoyces屬增加，而Dominikia屬和Ilyonectria屬減少（附件13：圖S8a）。最后，在接種病原菌的Picual植株根際，除了出現Verticillium外，Preussia屬和Chaetomium屬也增加了；而在未接種植物中，Fusarium、Glomus、Septoglomus和Dominikia減少（附件13：圖S8b）。

接種Verticillium dahliae后，微生物群落網絡拓撲結構發生的重大變化

Uncovering alterations in the belowground microbiota of olive cultivars upon inoculation with Verticillium dahliae D pathotype共現網絡分析表明，每個微生境（根內和根際）中群落成員間的相互作用差異很大。在結構（DNA）和功能（RNA）群落之間也存在差異。有趣的是，即使每個微生境的結構和功能群落相似（見上文），在接種病原菌后品種之間也發現了顯著不同的網絡（p < 0.0005）（表3）。例如，在接種V. dahliae后，Frantoio根內結構群落轉為高度連接（見avgK、GD和avgCC參數）、低模塊化（見Modularity參數）的網絡（表3）。盡管程度較小，功能群落也呈現出相同的趨勢（表3）。相反，Picual植物在根內顯示出截然不同的網絡拓撲結構（即接種病原體后，較低的連通性和較高的模塊化程度），功能群落表現出更明顯的變化。然而，在兩個品種的根際，在有病原體存在的地方(見上文)，群落在結構(DNA)和功能(RNA)水平上都表現出相似的網絡拓撲結構變化：節點間連接性降低，節點間距離增加，區域化(模塊化)程度增加。結構和功能群落之間的唯一區別是后者的測地距離（GD）減小（表3）。值得一提的是，在所有情況下，V. dahliae的接種增加了負相互作用的數量，如正邊緣百分比（PEP）的降低表明對根內功能群落影響更加明顯（表3）。在根內方面，接種V. dahliae后，兩個品種的關鍵OTU均發生了變化。最顯著的變化是接種V. dahliae后植物結構群落中缺乏Glomeromycota（球囊菌門），伴隨著功能群落中一些Ascomycota（子囊菌門）的出現（附件14：圖S9；附件15：圖S10）。有趣的是，在沒有病原體侵入的情況下，在這種微生境網絡中缺乏Glomeromycota（球囊菌門）并出現Ascomycota（子囊菌門）OTUs。由于接種了V. dahliae，Frantoio植物的結構和功能群落網絡出現了最明顯的變化（圖3；附件16：圖S11）。未接種的對照植物的結構群落中的關鍵OUT，分類為Glomus、Rhizophagus (Glomeromycota)、Phenylobacterium、Xanthomonas、Ferrovibrio、Sphingomonas、Gammaproteobacteria (Proteobacteria)、Microbaceteriaceae (Actinobacteria)和Roseimicrobium (Verrucomicrobia)。然而，在接種病原菌后，前者被Steroidobacter、Rhizobium、Pseudomonas、Brevundimonas、Ancylobacter、Legionella、Hylemonella (Proteobacteria)、Streptomyces、Actinomycetales (Actinobacteria)、Opitutus、Prosthecobacter (Verrucomicrobia)、Dyadobacter、Chitinophagaceae (Bacteroidetes) 和兩種未分類菌所取代。在兩種情況下，只有Devosia和Hydrogenophaga（Proteobacteria）存在，盡管Devosia從3個代表性OUT減到1個（附件14：圖S9）。未接種的Picual結構群落的主要OTU是Rhizophagus (Glomeromycota)和Roseimicrobium (Verrucomicrobia)，像Frantoio 中的Rhizophagus (Glomeromycota)、 Stenotrophomonas、Devosia、Steroidobacter、Luteimonas、(Proteobacteria)、Actinoplanes (Actinobacteria)和Bacillus (Firmicutes) 一樣。與與Frantoio菌群相似，接種后，所有的主要OTU均被Flavobacterium (Bacteroidetes) 和Sphingomonas、Rhodanobacter、Peredibacter、Devosia和四個未分類屬所取代，它們都屬于Proteobacteria（變形菌門）（附件15：圖S10）。在根際，共現網絡分析表明，接種V. dahliae后，Picual植物的結構群落發生了最明顯的變化，GD和模塊性的急劇增加清楚地證明了這一點（表3）。無論是在結構（DNA）還是功能（RNA）水平，這兩個品種之間最明顯的變化是在Picual網絡中出現了Verticillium。相反，在Frantoio網絡中未觀察到此變化（圖4；附件17：圖S12）。

討論

本研究的目的是揭示與兩個對VWO敏感性不同的橄欖品種相關的根際和根內微生物群落的結構、功能和相互作用，并確定V. dahliae的引入如何改變它們。我們的研究的第一個相關結果是，無論是植物基因型還是接種V. dahliae，都不會顯著影響兩個橄欖品種的根際和根內微生物群落，如α和β多樣性的分析所揭示的那樣。在T0和其他采樣時間點（T8，T15和T30 dai）觀察到的唯一恒定的變化是，加150mL水（對照，未接種組）或150mL V. dahliae分生孢子懸浮液（接種組）會對原生微生物群落有明顯影響。

群落分類單元相對豐度變化最顯著。通過比較不同品種未接種植株的微生物群落，發現一些有趣的差異值得探討。在門水平上，無論是根際還是根內，無論是結構(DNA)還是功能(RNA)群落，Picual中Candidatus Saccharibacteria的相對豐度都較高，而Frantoio 中Proteobacteria的相對豐度更高。Candidatus Saccharibacteria，以前被稱為Candidate Division TM7，最近被認為是抑制細菌性枯萎病的關鍵生物標記，可指示植物的病態和脅迫態[34]。本研究表明，煙草植株中Candidatus Saccharibacteria和R. solanacearum的相對豐度呈負相關。與該發現一致，我們發現接種V. dahliae后，Picual植物的根際結構群落中的Candidatus Saccharibacteria減少（圖2a），這可能是該品種經歷生物脅迫后的結果。相反，在Frantoio群落中沒有發現這個門的任何變化。推測該門可能是Picual遭受病原菌脅迫后的指示，這種脅迫可能與該品種易感VWO有關。我們想強調的是，在根際微生物群落中，更重要的是，與在Picual中觀察到的情況相比，在未接種的Frantoio植物根際微生物群落中，相對豐度較高的屬被認為是植物促生微生物（PGPM）。一方面，在耐VWO品種的根際細菌群落中，必須強調這些屬：Acidovorax（據報道能促進大麥生長[35]）、Neorhizobium（與辣椒生物量刺激有關[36]）、Nocardia、Ancylobacter（產植物激素吲哚-3-乙酸(IAA) [37，38]）和Lentzea（與小麥生長刺激有關[39]）。關于真菌，Acremonium屬值得一提，因為它參與植物生長[40]。另一方面，在Frantoio根內，下列細菌屬豐度明顯較高：Neorhizobium、Bradyrhizobium（能夠在豆類中形成固氮結節，并在蘿卜、番茄和水稻中形成結節狀結構[41]）、Sphingomonas（據報道可增加中藥植物生物量[42]）、Actinoplanes（參與促進黃瓜生長[39]）和Caulobacter（被報道可產薰衣草的植物激素[43]）。關于真菌和根際報道，還發現了Trichoderma（著名的PGPM和BCA）和Acremonium屬（如[44]）。王等[24]認為健康土壤中的有益微生物可以促進植物生長，并控制土傳疾病，與之一致，我們發現與Picual觀察到的情況相比，Frantoio微生物群落中PGPM豐度較高可能與其耐VWO有關。相反，Picual根內群落中真菌（如Fusarium、Macrophomina和Rhizoctonia）相對豐度更高，這些屬以包含植物病原菌而聞名 [45-47]。我們推測，這些屬中有害代表的存在可能以某種方式增加了Picual根對V. dahliae攻擊的敏感性。與此相關，Khoury和Alcorn[47]報道了兩個根系損傷的棉花品種被Rhizoctonia solani感染，這可能會阻礙植物通過物理屏障阻止V. albo-atrum定植。Picual和Frantoio的細菌根內生菌群落在某些類群相對豐度上顯示出顯著變化，這可能是由于接種了V. dahliae所致。例如，Picual根內顯示出Acidobacteria（酸桿菌門）的減少。這與該門的存在與植物健康有關，并且該門的減少與R. solanacearum感染的煙草的病態有關[48] 的研究結果一致。同樣的情況很可能發生在VWO易感的橄欖品種上，而在Frantoio植物中卻沒有。相反，在Frantoio的根內群落中觀察到Actinobacteria（放線菌）減少（但在Picual中未觀察到），與此形成對照的是，有研究報道該門使番茄對V. dahliae抗性增強 [49]。

我們研究的另一有趣結果是，檢測到根際（病原體首先與植物直接接觸的微生境）群落的變化。其中，Frantoio植物的結構和功能微生物群落僅在其相關的細菌區系和真菌區系的次要門中有顯著變化，說明V. dahliae的引入對VWO耐受品種的影響較小。相反，接種V. dahliae后Picual根際群落發生了重大變化。事實上，由于V. dahliae的存在，VWO易感品種中6個門出現了顯著變化，最有趣的是Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）的減少。值得一提的是，在其他研究中也有根際Gemmatimonadetes（芽單胞菌門）相對豐度與V. dahliae感染呈負相關的報道[50]。Inderbitzin等人[51]也發現了V. dahliae感染后Proteobacteria（變形菌門）增加，這與我們的結果一致。Proteobacteria（變形菌門）對植物健康的活性和積極作用已得到充分證明[19]。真菌方面，接種病原菌后，Picual根際Glomeromycota（球囊菌門）的相對豐度顯著降低。該門的屬被歸類為AMF，眾所周知，AMF通過幾種作用方式對宿主植物的健康狀況起作用，包括激活對土傳病原菌(如：Phytophthora（疫霉菌）、Fusarium（鐮刀菌）、Verticillium（黃萎病菌）)的防御機制。AMF的有益作用已在其他地方進行了全面綜述[52]。此外，根內/根際Glomeromycota（球囊菌門）的相對豐度的高比率與雜草對策（其特征是能快速地定居在無競爭者的環境中）中AMF的生物量比率一致，其特征在于能在沒有競爭者的生境中快速定植，這些生境由于最近的干擾而沒有競爭者。由于在我們的溫室試驗條件下，既沒有限制條件（例如養分），也沒有脅迫條件（如溫度、水），所以在未接種植物（和兩個品種）中發現的根內/根際比率與AMF群落建立的早期階段一致[53]。但是，在接種V. dahliae后，Picual根際這一比率增加，Glomeromycota（球囊菌門）顯著減少，可能是由于AMF的保護作用。這與Newsham等人[54]的觀點一致，他們認為AMF的活動主要集中在根內，對病原菌起防御作用，而不是作為營養動員劑。此外，觀察到AMF根內/根際比率的改變可能表明Picical植物在接種病原菌后處于脅迫狀態，部分解釋了該品種對VWO的高易感性。

我們想強調的是，在比較未接種和接種V. dahliae的植物時，沒有一個橄欖品種在分類單元上存在/缺乏顯著差異。此外，在結構和功能水平上也沒有差異。的確，在未接種的兩個品種的植株上，細菌組和真菌組核心幾乎完全相同，在后者和接種病原菌的植物中發現了類似情況。這說明了一個事實，Frantoio和Picual似乎在招募并庇護相似的地下微生物群落，而接種V. dahliae并沒有引起這些群落多樣性的顯著變化，至少在我們的實驗條件下是這樣。分類單元共現模式的網絡分析為復雜微生物群落的結構提供了新見解，否則很難用微生物生態學中廣泛使用的標準α/β多樣性指標[30]來揭示。已有研究表明，復雜的土壤微生物群落網絡（具有高節點數、連接數和平均連接度的網絡），而不是簡單的某一微生物，對植物有益[28]。確實，復雜的網絡有利于更好地應對環境變化或抑制土傳病害。例如，與網絡中連接度較低的群落相比，具有復雜網絡的煙草根際微生物群落發生細菌性枯萎病的幾率較低[29]。同樣，在甘藍型油菜種子的微生物群落中，觀察到緊密結合和復雜的微生物網絡，并被認為是新來者(無論是有益的還是致病的)難以入侵這些生態位的特征。我們的發現與這些研究一致。事實上，與Picual相比，接種V. dahliae后，Frantoio根內群落在共現網絡中復雜性顯著增加(表3和圖3)。共現相互作用的研究主要集中在根際和葉際微生境[29，30]。據我們所知，這是我們首次采用這種方法來評估根內群落，以及在引入土傳病原菌后該微生境中發生的拓撲變化。

接種V. dahliae后，兩個品種的根際微生物群落的復雜性均有所下降。這種變化在Picual中更為顯著，特別是在結構群落中。此外，在兩個品種中還觀察到根際微生物網絡的模塊性同時增加。Delmas等人[56]提出了通過增加模塊化和GD來維持群落穩定，從而保護群落免受病原菌的干擾。的確，Cardinale等[32]的研究表明，與生菜根部松散的細菌網絡相關的土傳病原菌的生物防治有所增加。因此，通過減少受影響模塊和相鄰模塊之間的相互作用（共現或共排斥），可以減輕V. dahliae的負面影響[55]。原則上，這兩個品種的根際微生物群落遵循相同的策略，這一策略在Picual植物中注定失敗，因為病原菌與最大模塊OTUs的相互作用強烈（圖4；附件16：圖S11）。這種相互作用可以解釋在Picual根際結構群落中觀察到GD的增長比在Frantoio中更高。然而，由于目前可用技術的局限性[57]，不能完全排除病原菌可能也與Frantoio植物的根際微生物群落發生了相互作用，這種情況在Picual中可以清楚地觀察到。最后，我們的結果還表明，與耐性品種（Frantoio）相比，在VWO敏感品種（Picual）中引入V. dahliae會增加負面相互作用（如競爭和拮抗）的數量。

結論

橄欖品種對V. dahliae的差異敏感性主要歸因于宿主根部的基礎病原菌和早期病原體菌誘導的差異轉錄反應[10]，以及與不同品種根部相互作用時病原菌的定性和定量差異轉錄反應[ 58]。在本研究中，還建立了VWO耐受水平與橄欖地下常駐微生物群落之間的聯系。一方面，我們的研究結果強調有必要在整體概念框架內研究對生物脅迫的耐受性，以期在林木作物農業中獲得更全面的視角[59]。另一方面，研究結果也為VWO抗性的生物防治和育種等研究領域開辟了新思路。關于生物防治策略問題，VWO耐受品種相關群落中有益屬的豐度較高，這一事實值得關注，可用于識別新型潛在BCA和/或PGPR。此外，還必須評估顯著抗VWO的BCA[12-14] 的引入對地下群落的結構、功能和網絡交互的影響。這與出現大量潛在有害組分的群落有關，如在VWO易感Picual中所報道的一樣。這些信息也可能與橄欖育種計劃有關，該計劃旨在培育VWO抗性/耐性的改良新品種，其中必須考慮地下常駐微生物群的作用。此外，由于橄欖樹在苗圃的繁殖主要和傳統上是通過莖扦插生根來進行的，因此了解在根系生長過程中招募并建立的根相關微生物區系的微生物成分似乎是最重要的。雖然接種V. dahliae后對橄欖地下微生物群落的結構(DNA)和功能(RNA)沒有顯著改變，但微生物共現相互作用在接種V. dahliae后出現顯著變化（綜述的簡化方案如圖5所示）。本工作首次揭示了根內微生物網絡拓撲結構的變化與不同品種對相關土傳病原菌的耐受水平之間的相關性。僅在VWO易感品種群落的共現網絡中檢測到V. dahliae，表明病原菌被引入后在群落中起著中心作用，而Frantoio則成功地將其限制在最相關的模塊之外。對微生物群落共生相互作用的深入研究表明，共現網絡是揭示微生物區系對生物脅迫是耐受還是易感的有力工具，我們鼓勵在其他樹木病理系統中進行研究。

材料方法

【樣本收集】

兩個品種（Picual和Frantoio，分別為VWO易感型和耐受型[10]）的橄欖樹（3個月大）來自Córdoba省的一個商業苗圃，用于溫室試驗。從苗圃接收后，將橄欖樹種在盆中（11×11×12 cm，每盆一株），每盆中含無菌土（70%，w/w）、沙子（7.5%）和商業苗圃盆栽基質（7.5％），其中土壤收集自Córdoba市的世界橄欖種質收藏庫。在接種病原菌前，將橄欖樹在溫室（自然光照，晝夜溫度27/21℃）中培養（馴化）3個月，使適應新環境。馴化期結束后，每盆接種150 mL V. dahlia V-9371（D病型代表菌株）分生孢子懸浮液（1×106分生孢子/mL）[60]。對照組（不接種V. dahlia）澆150 mL水。接種V. dahlia后，在0天（每個品種4株對照）、8天、15天、30天（每個品種每個時間點4株）取樣收集每棵橄欖的根組織及根際土壤。采集根際土壤2g，-80℃保存于LifeGuardTM土壤保存液(MoBio Laboratories Inc.，Carlsbad, CA, USA)中，直至使用。采集根，用20 mL 0.8%的NaCl渦流清洗，去除附著土壤。之后用蒸餾水清洗5次。表面消毒：70%酒精5min，次氯酸鈉(3.7%)，0.01%吐溫20 3min，最后在無菌蒸餾水中沖洗3次。然后，立即將根組織冷凍在液氮中，并儲存在?80℃直到使用。為了確認消毒的效果，將最后漂洗使用的無菌水接種于NA(營養瓊脂)和LB平板上，在28℃下培養7天。然后，檢查培養皿中是否被微生物污染。

【DNA和RNA提取和Illumina測序】

在收到樣品的24h內，遵照說明書，用RNA PowerSoil Total RNA Isolation kit和RNA PowerSoil DNA Elution accessory kit(MoBio, Laboratories Inc., CA, USA)提取土壤樣本中的RNA和DNA。用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)提取根中的RNA，然后根據說明書，用DNase I（Qiagen）去除污染的基因組DNA，隨后用RNeasy MinElute cleanup Kit (Qiagen)進行純化。根據說明書，用Nucleon? Phytopure植物DNA提取試劑盒(GE Healthcare UK Ltd, hamshire, UK) 提取純基因組DNA。按照Lasa等人[61]的方法獲得cDNA。cDNA和DNA的產量和質量均通過在0.8% (w/v)的瓊脂糖凝膠中進行電泳來檢測，該凝膠用GelRed染色并在UV燈下可視，使用Qubit 3.0熒光儀(Life Technologies, Grand Island, NY)檢測。在西班牙格拉納達的寄生蟲和生物醫學研究所“Lóp ezNeyra”（CSIC）的基因組學服務處，用Illumina MiSeq平臺對cDNA和DNA進行了測序。在第一輪中，根據Takahashi等人的研究[62]，使用引物對Pro341F（5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′）和Pro805R（5′-GACTACNVGGGTATCTA ATCC-3′），通過擴增cDNA和DNA中16S rRNA基因的高變區V3-V4，構建原核庫。這些擴增子被標記到PNA PCR夾上，以減少質體和線粒體DNA擴增[63]。在第二輪中，使用引物對ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[64]和fITS7（5’-GTGARTCATCGAAT CTTTG-3’）[65] ，通過擴增cDNA和DNA的 ITS2區域，構建真核庫。兩輪均使用配對末端2 x 300 bp (PE 300)策略進行測序。

【數據質量篩選和重疊】

基于特定的條形碼對樣品進行信號分離，用FastQC v.0.11.5[66]對Phi-X174-free reads進行質量檢查，用FASTX-Toolkit v.0.014[67]進行末端裁剪。丟棄所有低質量序列，直到達到高于Q20的質量值。將paired reads與fastq-join v.1.3.1[68]進行重疊，要求重疊區域的最小重疊值40 bp，最大差異為15%。這兩個庫均使用相同的生物信息學工具進行處理，但操作途徑不同，詳情如下。

【原核生物的數據處理】

用SEED2 v.2.1.05[69]和MOTHUR v.1.40.5[70]軟件對原核序列進行修剪和聚類。使用SEED2丟棄特異性引物，消除所有歧義、長度小于384 bp或平均閱讀質量低于Q30的序列。之后，用MOTHUR，用SILVA gold reference fasta去除嵌合讀段，并將高質量序列以97％的簇集到OTU中。最后，根據Bokulich等[71]人的方法，去除了少于總序列0.005％的OTU。此外，在剩余的OTU中，將每個樣本中少于總序列0.005%的OUT修正為0，根據所使用的MOCK群落(ZymoBIOMICS Microbial Community Standard II (Log Distribution), ZYMO RESEARCH, CA, USA)。OTU用80％的引導程序分類到核糖體數據庫計劃（RDP-II）16S rRNA參考數據庫，訓練集v.16 MOTHUR-formatted中[72]。從數據集中刪除了識別為線粒體，葉綠體和未知序列（在kingdom level未分類）的序列。

【真核生物的數據處理】

在SEED2中，通過去除模糊的和平均讀取質量低于Q30的序列，對真核庫進行質量修飾。去除特異性引物和小于290 bp的那些序列。隨后，用MOTHUR中的工具VSEARCH “De Novo”，對嵌合序列進行識別和丟棄，對高質量序列進行基于距離的貪婪聚類，其相似度為97%。根據網站建議的參數并使用Findley等人[74]的方法，使用UNITE v.7.2動態數據庫[73]對最豐富的OTU序列進行了分類。在OTU表中應用了與原核數據相同的OTU修整。最后，僅保留了屬于真菌界的OUT，以供進一步分析。

【核心微生物建設】

構建DNA和RNA核心細菌組和真菌組時，只考慮了每個處理中至少90%重復出現的屬[75]。共有核心屬存在于兩個品種中；特定核心屬存在于一個品種中，但在另一品種10%以上的重復中缺失。構建完成后，將核心微生物群落繪制在維恩圖中。

【統計分析】

所有分析均使用Fernández-González等人先前描述的腳本進行[18]。簡單來說，將α多樣性指數（Observed和Chao1豐富度；Shannon和InvSimpson）與KruskalWallis檢驗進行了比較，并使用R包agricolae 用Benjamini-Hochberg法通過FDR校正p值。對于β多樣性，使用BioConductor軟件包edgeR，用“trimmed means of M” (TMM)方法，對過濾后的OTU序列計數進行歸一化處理。通過含9999個置換的vegan包中adonis函數和betadisper函數的PERMANOVA（置換多元方差分析）和BETADISPER方法進行歸一化。在適用的情況下，使用軟件包pairwiseAdonis中的pairwise adonis函數來評估組間的成對差異。為了可視化研究群落間異同（相似或差異），通過NMDS（非度量多維尺度分析）和PCoA（主坐標分析）繪制出在PERMANOVA分析中有差異的結果。用Bray-Curtis差異在兩個維度上對ordinate（排序）各處理間的β多樣性方差。使用R軟件包phyloseq進行排序分析。對于每個顯著的PERMANOVA比較，選擇NMDS還是PCoA取決于哪一個最能代表置換分析的結果。通過STAMP v.2.1.3軟件，使用非標準化計數中的比例測試不同分類單元的豐度，獲得生物學相關的原核和真菌門、目和種，多組比較用ANOVA Games-Howell’s post hoc檢驗，兩組比較用Welch’s t檢驗，使用Benjamini-Hochberg FDR對多次檢驗進行校正。篩選出上述兩種方法中具有統計學顯著差異的分類單元，僅保留那些比例差異≥0.5％或比例≥2的分類單元，認為其具有生物學相關性，并進行最終選擇。

【網絡構建、比較和可視化】

首先，為每個品種（Picual和Frantoio）、每個區室（根內和根際）、每個核酸（DNA和RNA）和每種處理（對照和接種V. dahlia）分別構建細菌和真菌網絡。在每個網絡中，除Frantoio DNA對照組（n=15）中的Fra_3_0_P和Picual DNA和RNA接種組（n=11）中的Pic_1_30_S外，所有時間點和重復數（對照組n=16，接種組n=12）被認為是不同OUT之間更準確的相互關系。然后，為構建這16個網絡，按照開發者的建議使用MENAP網站(http://ieg4.rccc./mena/main.cgi) [28,31,76-78]。從默認選項更改的唯一參數是分離方法。的確，根據Jiemeng等人[28]的推薦，選擇用模擬退火法代替貪婪模塊化優化。此外，為利用品種間經驗網絡的Student t檢驗比較的全局屬性的標準偏差，對每個經驗網絡執行了100個隨機網絡。所有網絡均采用Cytoscape v.3.7.1繪制[78]。最后，在Excel (ZiPi圖)中繪制關鍵的OTU，并比較兩個處理在品種、區室和核酸間的差異。

圖表

圖1 橄欖品種根內群落在門水平上的分類學特征。a、c結構(DNA)群落；b、d功能(RNA)群落圖2 橄欖品種根際群落在門水平上的分類學特征。a、c結構(DNA)群落；b、d功能(RNA)群落

表3 Frantoio和Picual共現網絡的主要拓撲性質

圖3 Frantoio和Picual（對照和接種Verticillium dahliae）根內結構群落的共現網絡。數字對應按大小排序的模塊數量

圖4 Frantoio和Picual（對照和接種Verticillium dahliae）根際結構群落的共現網絡。數字對應按大小排序的模塊數量

圖5 橄欖樹品種的主要研究成果（地下微生物群落的比較和Verticillium dahliae接種在微生物網絡中的作用）示意圖。在網絡中，紅色的邊表示模塊間的負相互作用(實心圓)。紅色圓圈表示包含V. dahliae的模塊。在底部表格中，品種比較部分（左）顯示了未接種時Frantoio或Picual群落中相對豐度顯著較高的細菌和真菌屬。接種V. dahliae影響效果（右）顯示了接種病原菌后最顯著的變化，在分類學（每個微生境下微生物分類單元的相對豐度，箭頭：減少（紅色）；增加（綠色））和網絡（每個微生境下OTUs，箭頭：消失（紅色）；出現（綠色））水平上。

補充信息

附件1：表S1 研究樣本的編碼和描述，細菌和真菌群落也用同樣的編碼 附件2：圖S1 接種Verticillium dahliae后，Picual根際細菌結構(DNA)群落在門水平上的顯著變化。No/green: 未接種; Yes/red：接種Verticillium dahliae。附件3：表S2 在未接種條件下培養的“Frantoio”（黃色）和“Picual”（綠色）的核心細菌群。淺棕色為共享的核心菌群。紅色的屬為RNA(功能群落)核心。黑體字表示相對豐度為> 1%的主要屬(兩個品種之和)。附件4：表S3 在接種Verticillium dahliae條件下培養的“Frantoio”（黃色）和“Picual”（綠色）的核心細菌群。淺棕色為共享的核心菌群。紅色的屬為RNA(功能群落)核心。黑體字表示相對豐度為> 1%的主要屬(兩個品種之和)。附件5：圖S2 未接種的“Frantoio”（綠色）和“Picual”（藍色）植物之間有顯著差異的屬。圖中顯示了根內結構（a）和功能（b）細菌群落。附件6：圖S3 接種Verticillium dahliae后，“Frantoio”（a）和“Picual”（b）根內細菌結構（DNA）群落中顯著變化的屬。No/green: 未接種; Yes/red：接種Verticillium dahliae。附件7；圖S4 未接種的“Frantoio”（綠色）和“Picual”（藍色）植物之間有顯著差異的屬。圖中顯示了根際結構（a）和功能（b）細菌群落。附件8：圖S5 接種Verticillium dahliae后，Frantoio和Picual根際細菌結構和功能群落中呈顯著變化的屬。No/green: 未接種; Yes/red：接種Verticillium dahliae。附件9：表S4 在未接種條件下培養的“Frantoio”（黃色）和“Picual”（綠色）的核心真菌群。淺棕色為共享的核心菌群。紅色的屬為RNA(功能群落)核心。黑體字表示相對豐度為> 1%的主要屬(兩個品種之和)。附件10：表S5 在接種Verticillium dahliae條件下培養的“Frantoio”（黃色）和“Picual”（綠色）的核心真菌群。淺棕色為共享的核心菌群。紅色的屬為RNA(功能群落)核心。黑體字表示相對豐度為> 1%的主要屬(兩個品種之和)。附件11：圖S6 未接種的“Frantoio”（ 波爾多）和“Picual”（ 紫羅蘭）植物之間有顯著差異的屬。圖中顯示了根內結構（a）和功能（b）真菌群落。附件12：圖S7 未接種的“Frantoio”（ 波爾多）和“Picual”（ 紫羅蘭）植物之間有顯著差異的屬。圖中顯示了根際結構（a）和功能（b）真菌群落。附件13：圖S8 接種Verticillium dahliae后，Frantoio和Picual根際真菌結構和功能群落中呈顯著變化的屬。No/green: 未接種; Yes/red：接種Verticillium dahliae。附件14；圖S9 ZiPi圖突出了接種Verticillium dahliae后Frantoio根內微生物結構（a）和功能（b）群落的關鍵OTUs。表中是每個關鍵OTU的詳細資料。附件15：圖S10 ZiPi圖突出了接種Verticillium dahliae后Picual根內微生物結構（a）和功能（b）群落的關鍵OTUs。表中是每個關鍵OTU的詳細資料。附件16：圖S11 接種前后，兩個品種根內功能（RNA）群落的共現網絡 附件17：圖S12 接種前后，兩個品種根際功能（RNA）群落的共現網絡。