【原】MPB：中科院城環所蘇建強、朱永官等-功能基因高通量定量方法

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功能基因高通量定量方法

High-Throughput qPCR Assays for Functional Genes

安新麗¹，栗利娟^{1, 3}，周昕原^{1, 3}，黃福義^{1, 3}，朱永官^{1, 2}，蘇建強^1,*

¹城市環境與健康重點實驗室，中國科學院城市環境研究所，廈門，福建省；²城市與區域生態國家重點實驗室，中國科學院生態研究中心，北京；³中國科學院大學，北京

*通訊作者郵箱：jqsu@iue.ac.cn

摘要：高通量定量PCR的原理是在模板DNA的PCR反應體系中加入熒光基團，進行高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環聚合酶鏈式反應。高通量定量PCR包括染料法和探針法，其通過熒光信號實時監測PCR反應進程，實現熒光信號積累與PCR產物形成同步，進而求得Ct值，獲得擴增曲線和溶解曲線。同時利用已知模板濃度的標準品做對照，進而獲得未知樣本目的基因拷貝數。功能基因高通量定量PCR方法是基于日本TAKARA公司SmartChip微孔芯片可進行高通量、高密度、納升級別的實時定量PCR的方法。高通量定量PCR需要采用納升級多樣品自動加樣器將樣品分配到微孔芯片上，并通過高密度實時定量PCR儀收集熒光信號，獲得Ct值。微孔芯片一次運行可以進行5184個獨立擴增反應，單孔反應體系僅100 nL，規避了以往傳統qPCR方法的基因檢測單一化、費用成本高和效率低等缺點。該方法具有高通量、低樣本量、低成本、周期短、操作簡單等優勢，可廣泛適用于各種環境樣本，例如水體（湖泊、海洋、污水、地下水等）、土壤、植物、沉積物、糞便、氣溶膠顆粒等樣品的功能基因標志物的精確定量和SNP基因分型等。

關鍵詞：高通量熒光定量，標準曲線，絕對豐度，微孔芯片

材料與試劑

1.各種型號吸頭（Mettler Toledo company，Rainin，RC LTS）

2.SmartChip MyDesign Chip(s) （Takara Biomedical Technology，Clontech，640032）

3.384方孔板和封板膜 （Thermo Fisher，Thermo Scientific Nunc，264573）

4.無菌平底96孔板（Thermo Fisher，Thermo Scientific Nunc，174897）

5.LightCycler 480 SYBR Green I Master （Roche，4887352001，-20°避光保存，保質期通常6個月）

6.High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor （Life Technologies，4374966，-20°避光長期保存）

7.無核酸酶的PCR級水（任意供應商）

8.一次性無菌加樣槽 （Corning，Costar 4870）

9.PCR引物對及探針（任意供應商）

10.TaqMan? Gene Expression Master Mix（Life Technologies，4369016，4°避光保存）

11.無核酸酶的1X TE buffer pH 8.0（任意供應商）

12.ROX參比染料 (50X) （Life Technologies，12223-012）

13.牛血清蛋白BSA （Sigma，A1933）

14.0.2 ml, 1.5 ml和2ml離心管 （Axygen，MCT-150-C，MCT-200-C）

15.Invitrogen Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Fisher，Invitrogen,Q32851)

儀器設備

1.SmartChip Multisample Nanodispenser （Takara Biomedical Technology）

2.SmartChip Cycler（Takara Biomedical Technology）

3.離心機 （Eppendorf，5424 R，5430）

4.熒光定量PCR儀（Roche，LightCycler480II）

5.超純水 （任意供應商）

6.氮氣瓶（任意供應商）

7.移液器 （Eppendorf，3120000909，3122000035，3122000051）

8.Vortex蝸旋儀 （Scientific Industries，Vortex-Genie 2，SI-0246 (G560E)）

9.Qubit 4.0熒光定量儀（Thermo Fisher，Q33226）

實驗步驟

一、引物、探針和質粒的配制

1.模板DNA準備及質粒混標制備

1.1模板DNA樣品采用Qubit熒光定量儀檢測DNA濃度，確保DNA濃度統一稀釋為20-50 ng/μl的濃度。若樣品DNA濃度低于20 ng/μl，建議對樣品進行濃縮。針對氣溶膠、深層底泥、原生動物腸道等特殊樣品，由于其DNA量極低，建議直接進行高通量定量檢測。

1.2針對RNA樣品，準備100-600 ng的RNA，采用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor試劑盒對RNA進行反轉錄制備cDNA。

1.3每個質粒采用TE buffer溶解，按照每個質粒相同拷貝數進行合并，做成混合標液，最終濃度2×10⁸ copies/μl，總體積約500 μl左右。

2.引物和探針稀釋

2.1引物和探針干粉首先離心機微離，使得干粉聚集離心管底部（防止超凈臺稀釋引物或探針時粉末被吹出，造成引物或探針量減少），分別用TE buffer稀釋成終濃度100 μM的母液。

3.HT-qPCR用的引物板的配制

3.1針對SYBR Green染料法^[1-3]

1）采用無菌96孔板，在每一個孔中加入一個靶基因的相應上下游引物，并記錄相應位置。按下列體積在每個孔中添加：

100 μM forward primer    8.5 μl

100 μM reverse primer    8.5 μl

1×TE buffer              83 μl

Total volume             100 μl

3.2針對Taqman探針法^[4,5]

1）采用無菌96孔板，在每一個孔中加入一個靶基因的相應上下游引物及探針，并記錄相應位置。按下列體積在每個孔中添加：

100 μM forward primer     10.9 μl

100 μM reverse primer     10.9 μl

100 μM probe             3 μl

1×TE buffer              75.2 μl

Total volume             100 μl

二、標準曲線的測定

1.將混標進行10倍系列稀釋。系列稀釋的混標（2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²）作為標準DNA樣本，進行高通量定量分析，以不同基因標準質粒的對數值為橫坐標，以測得的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線^[4]。

三、高通量定量運行

1.高通量定量運行的技術流程如圖1所示。以72 assays×72 samples的陣列為例，簡要流程概述如下：

1.1.獲得原始實驗樣品后，對樣本中的微生物總DNA進行提取，之后對DNA樣品進行總量及純度檢測。檢測合格后將DNA樣品和qPCR所用的試劑添加至384孔板作為樣品板（Sample Sourceplate），同時將引物和qPCR所用的試劑添加至另一384孔板作為引物板（Assay Sourceplate）。采用高通量自動微量加樣設備分別將樣品板和引物板試劑添加至高通量qPCR芯片的微孔中，在SmartChip Real-Time PCR System 中實行qPCR反應及熒光信號檢測，并自動生成擴增曲線和溶解曲線。

圖1 高通量定量PCR技術流程^[4]

2.各試劑在微孔芯片運行的反應體系參考表1（SYBR Green染料法）和表2（Taqman探針法）。

表1. SYBR Green染料法熒光定量的體系（100 nl）

表2. Taqman探針法熒光定量的體系（100 nl）

3.根據以上終濃度分別配制sample plate mix和assay plate mix。以72 assays×72 samples的陣列為例：

3.1配制sample PCR reagent Mix（一個chip的量）。如表3：

表3 Sample PCR reagent Mix的配制

1）將配置好的 PCR regent mix 混合均勻，轉移進加樣槽中，按照72 assays×72 samples的陣列樣品分布格局（如圖1）避光條件下在384-well sample sourceplate上分配體積，每個孔中加樣體積如下：

Prepared mix   12.4 ul

DNA樣品      3.1 ul

注：排槍使用“倒吸法”防止氣泡產生，同時避光操作

3.2配制assay PCR reagent Mix（一個chip的量）。如表4（SYBR Green染料法）和表5（Taqman探針法）：

表4 SYBR Green染料法assay PCR reagent Mix的配制

表5 Taqman探針法assay PCR reagent Mix的配制

1） 將配置好的PCR regent mix混合均勻，轉移到加樣槽中，按照72 assays×72 samples的陣列樣品分布格局（如圖1）避光條件下在384-well assay sourceplate上分配體積，每個孔中加樣體積如下：

Prepared mix   12.4 ul

引物探針        3.1 ul

注：排槍使用“倒吸法”防止氣泡產生，同時避光操作

3.3將分裝好試劑的assay sourceplate和sample sourceplate的無菌384板上貼上封板膜，采用刮板將封板膜緊密貼在384板上，將384板于冷凍離心機4°，3500 x g離心5 min。隨后將384板置于4 ℃冰箱避光保存備用。

注：切勿反轉384板以免液體黏在封板膜上

3.4高通量定量儀器運行操作

1）運行SmartChip Multisample Nanodispenser儀器

注：該儀器主要用于將384板上的mixture分裝到芯片上

a.打開SmartChip Multisample Nanodispenser儀器開關；

b.檢查氣瓶氣體含量（確保氣體含量>0.3 mpa），檢查曝氣瓶，確保曝氣水瓶裝滿超純水；

c.檢查NaClO溶液瓶，每周更換一次NaClO溶液（NaClO有效氯終濃度0.2%，主要用于清洗管道除菌）；

d.打開氣瓶氣閥與曝氣水瓶氣閥，曝氣30min，壓力控制40 psi；

注：曝氣務必充分，否則導致芯片表面有水珠出現

e.曝氣完畢，關閉曝氣水瓶上的氣閥，在電腦操作界面進行daily warm up三次和tip clean一次；

f.設置參數—setup-mode-gene expression + Chip number --assays（72），samples（72）；

g.輸入引物板排列文件和樣品板排列文件，輸出layout—Chip number的layout文件；

h.分裝assay sourceplate即引物板，將384板放置儀器樣品分裝室內側（注：確保384板緊扣位置，且分裝樣品靠近最內側）。放置芯片，記錄芯片編號，并將標有編號的一端靠近分裝室最外側。點擊“dispense assays”—“yes”，運行完畢點擊“tip clean”3次。

i.取下芯片，采用濾紙覆蓋輕壓表面，檢查是否有水珠出現，小心在表面粘貼白膜，冷凍離心機4°，3500×g離心5 min。

j.取下assay sourceplate，同樣的方式置換sample sourceplate，重新放置已分裝引物的芯片（注：必須與前一步放置方向相同），點擊“dispense assays”—“yes”，運行完畢點擊“tip clean”3次。

注：每次芯片分裝完樣品注意一定要進行tip clean，分裝完所有樣品后務必進行daily clean。

k.取下芯片，采用濾紙覆蓋輕壓表面，檢查是否有水珠出現，小心在表面粘貼藍膜（注意貼膜方向），冷凍離心機4°，3500×g離心10 min。

2）運行SmartChip Cycler儀器

注：該儀器主要用于運行熒光定量PCR程序，收集熒光信號。

a.首先打開SmartChip Cycler儀器，隨后再打開電腦電源；

b.檢查氣瓶壓強，確保氣瓶總壓力不低于100psi，否則及時更換氣瓶，儀器運行時壓力維持在120 psi；

注：此步較為重要，影響后續熒光信號的收集。

c.設置需要的protocol，導入Multisample Nanodispenser儀器儀器上生成的layout文件，選擇project；

d.放置芯片，使藍膜周邊與儀器緊密粘貼，設置芯片信息，點擊“run”，運行儀器；

注：確保芯片放置方向正確。

e.選擇結果文件存放位置，檢查pressure是否處于“OK”狀態，檢查是否出峰。

f.運行結束后導出數據，點擊“analysis”，隨后選擇“file”下拉“save cell data as”保存為txt格式文檔。

3.5數據處理—計算功能基因拷貝數

1）使用Canco軟件獲得各基因在各樣本中的檢出情況和Ct值（擴增循環數），同時構建分別含有待檢測的功能基因的標準質粒，根據已知濃度的標準質粒的Ct值繪制標準曲線y=kx+b；

2）根據SmartChip Real-Time PCR System和Canco軟件給出的各基因在各樣本中的Ct值整理成Ct值總表并進行質控，質控條件如下：

a.當擴增效率小于1.8或大于2.2將舍棄該基因；

b.當陰性對照有擴增，則舍棄該基因；

c.當Ct值大于31時將認為沒有擴增，舍棄該基因在對應樣本中的Ct值。

注：其中在表格中標注“0”代表該基因在對應樣本中未檢出。而只有在三個技術重復中均被檢出的基因，才會將該基因判定為陽性，并計算其平均值作為該基因在對應樣本中Ct值。Ct值代表該基因在對應樣本中的擴增循環數，Ct值越小意味著該基因在對應樣本中的起始含量越高。

3）將樣本Ct值代入標準曲線公式，獲得樣本基因的絕對定量信息，統計各基因在各樣本中的基因數目。相對豐度的計算采用公式：相對拷貝數 = 10^(31-Ct)/(10/3)進行計算。

溶液配方

1.無菌384板、無菌槍頭及無菌離心管：采用高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為120°，30min，103.4kPa。

致謝

本工作的開展是在國家重點研發計劃(2017YFE0107300)，國家自然科學基金(31722004,21936006)等項目的支持下完成的，感謝科技部與國家自然科學基金委的支持。

參考文獻

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3.Zhu, Y. G., Johnson, T. A., Su J. Q., Qiao M., Guo G. X., Stedtfeld, R. D., Hashsham, S. A., Tiedje, J. M. (2013) Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms. Proc Natl Acad Sci U S A. 110(9): 3435-40.

4.An, X. L., Wang, J. Y., Pu, Q., Li, H., Pan, T., Li, H. Q., Pan, F. X., Su, J. Q. (2020) High-throughput diagnosis of human pathogens and fecal contamination in marine recreational water. Environ Res, 190:109982.

5.Zhuang, F. F., Li, H., Zhou, X. Y., Zhu, Y. G., Su, J. Q. (2013) Quantitative detection of fecal contamination with domestic poultry feces in environments in China. AMB Express 7(1): 80.