戴磊：22分鐘說透3大下一代微生物組技術

mingxiaozi 2021-01-29

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大家好，我是來自中國科學院深圳先進技術研究院合成微生物組研究中心的戴磊研究員。今天很高興來到我們的《腸·道》演講，和大家分享我關于微生物組工程方面的一些心得。

本演講的幻燈片 .pdf 版將在熱心腸菌群微信群分享，感興趣的讀者請按以下方法申請入群：

我們知道，目前的微生物組技術主要是分為測序和培養這兩條不同的技術路線。

拿我們非常熟悉的腸道微生物的研究為例的話，當我們從人體或者動物上面取得了樣本之后，我們可以提取其中的微生物的 DNA，進行宏基因組或者擴增子的測序，來分析得到其中的物種和基因的組成。

另外，最近幾年，也是非常火的一個方向就是高通量的培養組學。在實驗室當中，現在有越來越多的原來我們認為難以培養的腸道微生物物種，被我們分離培養得到，可以進行全基因組測序和各種各樣的表型研究，這也大大推動了我們對于腸道微生物組的功能的認識。

今天我想和大家分享的是下一代的微生物組技術。

在進入我們的主題之前，我想先和大家聊一聊基因組工程。

為什么聊基因組工程呢？因為我覺得在過去的半個世紀，隨著 DNA 雙螺旋結構的發現以及 DNA 作為遺傳物質的中心法則的確立，我們對于基因組的研究已經進入到了一個非常深入的層次上面。

基因組的精準解析技術和靶向改造技術，以及現在最前沿的合成基因組技術，給我們帶來了許多新的啟示，也打開了許多實際應用的大門。

那么基因組的精準解析是指什么呢？

如果我們把基因組上的 ATGC 比作一本書的話，那么一種一維的想法就是，我把這本書從頭到尾讀一遍我不就理解了嗎？

但其實并沒有這么簡單。我們現在發現，基因組當中可能有很多區域是不編碼蛋白質的，它有很多區域可能是不在特定的環境下、條件下表達的。那么讀這本書，從頭讀到尾，本身就不是那么容易的一件事。

第二，我們再進入一個層次。隨著 2000 年左右我們人體基因組的整個測序的結束，很多人認為，我們是不是能夠破解人體基因組的這本密碼天書了？其實并沒有這么容易。因為我們發現，許多基因之間存在著非常復雜的互作關系。

以這個網絡圖為例，我們可以想象，其中有一些基因，它就好像一個 hub（樞紐）一樣，可能同時調控許多其他基因的表達。那么這樣的網絡，通過系統生物學研究發現，它是一種 scale-free 的網絡，就是其中有一些節點是非常核心的，它可能跟大量的其他的基因相連接、相調控。那么這樣的系統生物學視角讓我們從另外一個維度理解了，基因組其實并不是一個一維的字符串，而是由許多相互作用的元件組成的。

再深入一些，如果我們從物理的 3D 結構來思考基因組的話，我們會發現，其實基因組有非常復雜的結構，上面有很多蛋白質來調控整個基因組的結構。那么蛋白質就決定了基因組哪些地方可能是沉默的，哪些地方是表達的。通過了解染色體的這樣一個 3D 的結構，我們對于整個基因組的表達有了更加深入的認識。那么這也是伴隨著我們精準解析的技術不斷地發展。

另外一個就是，我們除了能夠去讀基因組之外，很多時候我們需要去改它。為什么呢？很多時候，我們并不知道一個基因是如何發揮它的功能的。

今年（2020 年）得了諾獎的 CRISPR 技術，我想大家都不是很陌生了。它是一種以 RNA 為介導的、對基因組進行精準編輯的技術。通過對基因進行精準地敲除、插入，我們可以非常深入地研究特定基因的功能對于生物體表型的影響。

另外一個最前沿的領域，就是合成基因組技術。從最早的 Craig Venter 開始，從頭合成一個細菌的基因組，到 2017 年，以中國科學家在內的一個國際大科學計劃，完成了酵母的合成基因組，我們對基因組的從頭設計與合成的能力也在不斷提高。

其中合成基因組——像酵母，我們現在知道，可以把它的 16 條染色體變成一條染色體。我們在合成的過程當中，也顛覆了許多我們原來對于基因組的認識。

所以，這就引出了我今天想要聊的這個話題，就是微生物組的解析和調控的新技術。

仿照剛才基因組工程的這三個方向，我把微生物組工程歸結為微生物組的精準解析、靶向改造與合成微生物組。

我們都知道，人體微生物組被稱為“第二基因組”。人體有 2 萬多個基因。在我們身上生活的微生物的細胞數量大約與我們自身的細胞數相當，它的基因數量大約是我們的 100 倍以上。

對于這樣一個非常復雜的宏基因組，我們怎么樣能夠用基因組工程的思路，來對它進行解析、改造以及從頭合成呢？

首先，我想說一說微生物組目前研究的套路。這是一個我相信許多在我們領域內并不陌生的技術路線。

也就是說，當我們拿到了一個糞便樣本之后，我們可以提取其中的 DNA，然后進行二代或者三代測序，然后通過生物信息學的方法來得到其中的物種、基因通路的分布。然后，我們通過和人體的表型、大數據的比較，我們可以找到，其中到底哪一些微生物的物種可能與疾病相關，甚至開發出來具有可預測性的模型。

那么在過去的十幾年當中，這樣的研究越來越深入，也積累了大量的數據，為我們理解微生物與人體健康打下了非常好的基礎。

但是，相信大家也聽過一句話，叫做“腸道菌群，機制不明”。那么在未來的下一個階段的微生物組研究當中，我想我們不得不去思考，我們如何用精準解析的方法，來真正地發現微生物組與宿主互作的一些機制以及一些新的現象。

這里我想大家要思考的是，微生物組與時間、與空間以及與它的分辨率這幾個未知的問題。

這里我想先聊聊關于微生物組的動態變化。

這一塊我想其實在最近幾年，有越來越多的研究開始關注這個問題。就是我們很多的研究都是一個橫斷面式的，研究了很多不同人的微生物組，但是我們也要關注同一個個體隨著時間的微生物組的變化。

比如說，我們通過時序上面微生物物種組成的一個改變，可以很好地幫助我們去推斷其中一些關鍵的微生物之間的一些互作關系。

其次，通過對時序數據的分析，我們可以發現一些靜態的數據沒有辦法發現的一些現象。

比如說，微生物組在一個短時間的尺度上可能存在一些晝夜的節律，包括它的一個在穩態附近的波動與恢復；在長的時間尺度上，在我們的生長發育以及衰老的過程當中，微生物組也是一個動態變化的過程。理解動態變化的過程，以及理解為什么微生物在這樣一個過程當中存在不同的穩態，我想這是一個非常核心的問題。

另外一個，我想除了測序之外，其實大家經常會說“所見即所得”。那么測序，它的一個明顯的優勢就是非常高通量，但它的弊端就是它把樣本中間的一些異質性給抹去了。

我們現在知道，在不同的生態環境下，其實環境是存在大量的異質性的。比如說，在我們的腸道的不同區域就有不同的生化、生理以及宿主的不同的微環境。那么通過成像的方式，我們可以最直接地看到微生物組在一個微米尺度上面的分布。

這里給大家展示的兩個，是在腸道和人體口腔中的樣本的微生物組的成像技術。目前的技術可以使我們看到數種到十幾種這樣的不同的微生物在原位的一個分布。

我們也期待在未來的研究當中，不斷的技術的迭代，通過熒光雜交等等不同的技術，讓我們能夠非常完整和準確地看到微生物群落在原位的一個分布。

另外一個也是大家非常關注的一個領域，就是解析微生物組在亞菌種層次上的一個功能差異。

現在，隨著培養組技術的不斷發展，我們發現許多菌雖然是同一個種，但是可能有完全不一樣的功能。

就以我們大家經常談論的大腸桿菌為例的話，在實驗室當中大家把它當作一個模式生物來研究，它的底盤菌株是完全無害的。但是也有一些大腸桿菌會造成腹瀉，還有一些大腸桿菌有特定的毒力因子，會引發大腸癌。那么這些不同的菌株之間有什么區別呢？

在我們今年（2020 年）發表的一個綜述上面，我們就詳細地闡述了不同菌株之間的功能差異，以及我們目前可以研究的一些方法。

一類它們的差異是在基因層次上的，也就是說一些菌株有一些別的菌沒有的基因；另外一類是在單堿基突變 SNP 上的差異。這些不同的差異都會引起這些菌株不同的表型，比如說它的代謝能力、它在宿主體內的定植能力以及它的致病性。

在亞菌種層次上更深入地研究，相信會對于未來將微生物組與人體健康的因果關系研究，是能夠更加推進一步的。

第二部分，我想跟大家分享一下微生物組的靶向調控技術。

這里我用的是美國哥倫比亞大學 Harris Wang 教授的一個綜述。他也是在微生物組工程領域的一個先驅了。這里他用了兩個不同的維度，來描述我們對于微生物組的調控或者說擾動。

在一個軸上，我們考慮的是擾動的大小；但另外一個軸上，我們考慮的是擾動的特異性。大家可以看到，越往上的這幾個，也就是說它的靶向性是越強的。

這里面我就想跟大家重點分享一下其中幾個：一個是 phage，噬菌體；另外一個是 engineered probiotics，就是工程化的益生菌；最后一個叫 engineered mobile DNA，就是一種我們稱之為原位調控編輯的一種技術。當然它們通過調控的方式也是不一樣的，有通過化學的，有通過細胞的，也有通過 DNA 的直接調控。

首先聊聊噬菌體。

相信很多關注腸道的朋友也對噬菌體不陌生了，噬菌體其實是針對細菌的病毒，它也是細菌的天敵。在腸道中，噬菌體也扮演著非常重要的一個角色。

那么基于噬菌體的這樣一種靶向調控可以達到一個什么樣的效果呢？

在左邊的，就是 2019 年發表在 Nature 上的段屹博士的一個工作。他們通過分離了腸道中糞腸球菌的特異性的噬菌體，來研究這個菌和酒精性肝炎之間的一個關系。

他們發現，這個菌所帶有的 cytolysin（溶細胞素）是和肝炎有直接的關系的。通過利用這樣具有非常強的宿主特異性的噬菌體，來靶向地清除病原菌，可以直接地去驗證病原菌和酒精性肝炎之間的一個因果關系。

我想這也是我們在腸道研究中必不可缺的一個利器。通過這樣“做減法”的一種方式，可以讓我們真正地了解，哪一些菌可能是跟疾病有直接的因果關系的。

另外一個就是在改造宿主表型方面。南京農業大學的團隊發現，利用靶向于番茄青枯病病原菌的噬菌體，可以非常好地去調控整個植物微生物的群落，靶向地清除了病原菌，讓植物也恢復了健康。

未來我想這樣的技術會越來越多地應用到人體以及農業的微生物組的調控當中。

另一類呢，就是剛才提到的工程化的益生菌。

工程菌是什么呢？我們可以在細菌當中引入特定的基因線路，來實現細菌的一種非常精確的基因表達。

比如在腸道當中，我們可以定植一些益生菌，它們可以通過感應到特定的病原菌的存在，或者腸道的發炎或者出血，在特定的環境下誘導益生菌來表達一些蛋白，來殺掉我們的病原菌，或者是降低宿主的炎癥和出血。

這一類的技術在美國也已經被推上了臨床，作為工程菌的這樣一個開發的管線，目前已經應用于多種疾病的治療。

說完了我們的噬菌體“做減法”，以及工程菌這樣一種“做加法”的方式，那么我們就想，我們是不是未來真的能夠對微生物組這樣一個非常復雜的生態環境做任意的加減法？那這個就太厲害了。

其實這個想法并不是天方夜譚。這種被稱之為 in situ genome engineering 的一種方法，就是通過將外源的 mobile DNA 引入到微生物群落當中，來實現對菌群的原位編輯。基于現在已經有的類似于 CRISPR 等等這樣的系統，我們可以把這些基因特定地插入到一些微生物當中，或者對一些微生物進行靶向地清除。

我相信，這樣的一個原位編輯的技術，在未來是非常有可能顛覆我們對于微生物組的操控能力的。

最后一部分就是關于合成微生物組了。

其實剛才說了，合成基因組領域也是一個非常前沿、非常挑戰的一個東西。我們除了對微生物組進行它的表征和調控之外，我們未來是不是有可能真的去從頭合成一個復雜的微生物群落？我想這個是我們非常值得探索的一個前沿的領域。

這里我把它稱為“建物致知”。我們經常說“格物致知”，對吧。那么有一個非常著名的物理學家費曼，他就說：“如果你不能夠創造一樣東西，那么就說明你還不夠了解它”。

我想對于微生物組也是同樣的。我們有沒有可能在實驗室、在比較簡單的環境當中，真正地去構建一些合成的微生物群落？那么這個答案是肯定的。

這樣的合成的微生物群落，通過研究它，可以讓我們更好地去理解自然生態的微生物群落是怎么樣運作、怎么樣執行它們的功能的。它在數學模型的這種可控性和自然生態系統的復雜度之間，找到了一個非常好的平衡。其實，這樣的研究方法，和系統生物學在過去 20 年當中所運用的方法和思路，是非常相似的。

剛才提到了基因組測序完成之后，我們發現，其實有大量的基因之間存在互作，這樣一個復雜的網絡怎么去研究？

在 20 年前左右，當時合成生物學的一個開山之作，就是用了合成的基因線路。通過對于兩個蛋白之間的互作形成的基因開關，或者三個蛋白之間的互作形成的一些震蕩器，我們發現，其實用一些簡單的基因線路和數學語言，我們是可以很好地去理解一個復雜網絡中存在的一些 motif（網絡模塊）的。

那么在生態的層次上，在微生物生態的領域當中，我們有沒有可能用系統生物學的這種自下而上的角度去理解微生物組？

在左邊這個，大家可以看到的是一個非常復雜的物種互作的食物鏈的網絡。右邊這個，是一個在 12 種不同的腸道微生物物種當中組成的合成微生物群落的網絡。這里面的邊就代表著不同物種之間的一個互作。

通過在實驗室當中構建出來這樣的互作的網絡，我們可以找到其中哪一些物種可能是起到關鍵作用的，我們有沒有可能通過數學模型來真正的去指導我們對于微生物群落的調控。

最后，在合成微生物群落方面，除了在科學研究方面或“致知”方面，其實也有許多的研究，包括公司，在開展“建物致用”方面的研究。