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編譯：ye00ye，編輯：十九、江舜堯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 ARGs（抗生素耐藥基因）對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，造成了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)成本。作為ARGs主要來源和傳播途徑，人們開始關(guān)注環(huán)境中的耐藥基因組(病原性和非病原性細(xì)菌中ARGs的收集)和影響其分布模式的因素。城市環(huán)境是一個(gè)具有不同于任何自然環(huán)境的特定生物、化學(xué)和物理特性的系統(tǒng)，且與公共健康和日常生活密切相關(guān)。在全球城市化背景下，揭示城市微生物群落中ARGs的多樣性和組成及其對(duì)公共健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)越來越重要。 近年來，大量研究調(diào)查了各種城市環(huán)境中（如城市農(nóng)業(yè)系統(tǒng)、潛在金屬污染住宅區(qū)、再生水灌溉的城市公園、城市垃圾填埋場(chǎng)和城市供水系統(tǒng)）ARGs的來源和豐度。ARGs的高多樣性和豐富性是這些研究的一般結(jié)論，但大多數(shù)研究集中在如城市環(huán)境中的農(nóng)業(yè)和廢物相關(guān)系統(tǒng)上，而關(guān)于農(nóng)業(yè)、廢物或任何其他小型點(diǎn)源污染的城市環(huán)境相關(guān)信息卻有限。關(guān)于一般城市環(huán)境中ARGs分布和ARGs生成的影響因素等相關(guān)知識(shí)的缺乏阻礙了有效解決抗生素耐藥性這一公共健康問題。 在城市綠地中游玩會(huì)不可避免地接觸到草坪和土壤。這樣，包括耐藥菌群在內(nèi)的環(huán)境微生物群便會(huì)轉(zhuǎn)移到人類微生物群。因此，研究城市綠地中的ARGs分布，了解和監(jiān)測(cè)由于暴露于草坪和土壤中而造成的潛在人類健康風(fēng)險(xiǎn)就顯得很有必要。 在本研究中，研究者從澳大利亞大墨爾本的40個(gè)城市公園采集了草和土壤樣本。考慮到城市環(huán)境中微生物組成的潛在異質(zhì)性，從每個(gè)公園采集了三個(gè)樣本(每個(gè)樣本混合九個(gè)土壤芯)，以避免忽略同一地點(diǎn)樣本的差異。使用高通量qPCR分析大量ARGs，試圖以最小的點(diǎn)源污染獲得城市綠地抗性基因的分布概況。本研究的主要目的是(1)調(diào)查城市綠地植物(草葉層)和土壤微生物區(qū)系中ARGs的來源和分布；(2)找出影響城市綠地ARGs豐度和組成的最重要因素。 論文ID 原名：Antibiotic resistance in urban green spaces mirrors the pattern of industrialdistribution 譯名：城市綠地的抗生素耐藥性反映了工業(yè)分布的格局 期刊：Environment International IF：7.943 發(fā)表時(shí)間：2019年08月16日 通信作者：Qing-Lin Chen；Hang-Wei Hu 通信作者單位：澳大利亞維多利亞州墨爾本大學(xué)獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采樣地點(diǎn)和樣本收集 草和土壤樣本于2018年5月從大墨爾本(圖S1)的40個(gè)城市公園采集。期間天氣多晴朗、無降雨，溫度在12.6℃至19.5℃之間。沒有一個(gè)采樣公園受到再生水灌溉等任何潛在點(diǎn)源污染。每個(gè)公園，在相距至少100米的距離處收集三個(gè)土壤樣本，并為每個(gè)樣本混合從表面5厘米土壤中提取的九個(gè)土壤芯。用消毒剪刀從植物的地上部分采集草樣。每種(即植物和土壤)各收集120個(gè)樣品。所有樣品都被轉(zhuǎn)移到無菌塑料袋中，收集后立即冰藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。部分土壤樣品經(jīng)輕輕壓碎后通過2mm的篩子進(jìn)行土壤性質(zhì)分析，其余樣品在提取DNA之前儲(chǔ)存在-80℃。 土壤特性 依據(jù)澳大利亞土壤化學(xué)方法進(jìn)行所有土壤的特性分析。測(cè)量土壤電導(dǎo)率、pH、總碳、總氮、重金屬Cu和Fe的濃度以及土壤陽(yáng)離子交換容量(CEC)。 人類活動(dòng)參數(shù)數(shù)據(jù)的收集 人類活動(dòng)參數(shù)從澳大利亞統(tǒng)計(jì)局網(wǎng)站上收集。這些參數(shù)分為兩類：居民因素包括人口密度和平均家庭總收入；工業(yè)因素包括企業(yè)總數(shù)、制造業(yè)數(shù)量、電力、天然氣、水和廢物服務(wù)數(shù)量。 DNA提取 利用試劑盒根據(jù)說明書進(jìn)行DNA的提取。提取到的DNA濃度和質(zhì)量通過使用NanoDrop ND2000c spectrophotometer分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢查。DNA儲(chǔ)存于-20℃。 高通量qPCR 高通量qPCR(HT-qPCR)以確定ARGs的多樣性(即檢測(cè)到的靶基因的數(shù)量)和豐度。ARGs和MGEs的用相對(duì)豐度法測(cè)量。 16S rRNA基因的qPCR分析 樣品中細(xì)菌16S rRNA DNA的qPCR分析在Bio-Rad CFX384 realtime-PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。 Illumina 測(cè)序和數(shù)據(jù)處理 Illumina Miseq平臺(tái)，使用引物對(duì)341F:CCTAGGGRBGCASCAG和806R:GGACTACYVGGGTACTAT進(jìn)行測(cè)序。使用QIIME平臺(tái)進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)處理。使用UCLUST基于97%的相似性進(jìn)行OTU聚類。嵌合序列、葉綠體和線粒體OTU以及單個(gè)OUT被棄去。根據(jù)GreenBanks 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行注釋。 統(tǒng)計(jì)分析 在Excel中進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)單處理。所有的統(tǒng)計(jì)分析以P < 0.05作為顯著水平。使用R “vegan” 包進(jìn)行PCoA分析，評(píng)估抗藥性和微生物群落的概況。用普通最小二乘法(OLS)回歸模型確定MGEs、cint1基因和ARGs豐度之間的關(guān)系，使用r中的“ggplot 2”包進(jìn)行可視化。人類活動(dòng)因素和耐藥基因組之間的相關(guān)性通過Spearman的等級(jí)相關(guān)性使用SPSS25進(jìn)行研究。 隨機(jī)森林建模與結(jié)構(gòu)方程模型構(gòu)建 使用R中構(gòu)建隨機(jī)森林模型，來確定城市綠地抗生素耐藥性的主要預(yù)測(cè)因子。在隨機(jī)森林模型中，MGEs、土壤性質(zhì)、人類活動(dòng)因素、細(xì)菌豐度以及樣本中十個(gè)最豐富門的相對(duì)豐度作為ARGs豐度的預(yù)測(cè)因子。方差（MSG）的增加被用來確定ARGs豐度驅(qū)動(dòng)因素的重要性。計(jì)算每棵樹的均方誤差，并在5000棵樹上取平均值。 作者建立了結(jié)構(gòu)方程模型(SEMs)來測(cè)試土壤性質(zhì)、工業(yè)因素、細(xì)菌豐度和多樣性以及MGEs和ARGs豐度之間的偶然關(guān)系。基于已知的ARGs驅(qū)動(dòng)因素之間的效應(yīng)和關(guān)系，建立一個(gè)先驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>(圖S2)。使用SPSS 25確定Z-scores標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù)之間的成對(duì)相關(guān)性。協(xié)方差矩陣被導(dǎo)入AMOS 25用于SEM構(gòu)建。SEMs總體擬合優(yōu)度由多重?cái)M合優(yōu)度標(biāo)準(zhǔn)決定：χ2檢驗(yàn)P > 0.05，擬合優(yōu)度指數(shù)(GFI) > 0.90，近似均方根誤差(RMSEA) < 0.10。通過將直接和間接效應(yīng)相加，計(jì)算出每個(gè)驅(qū)動(dòng)因素對(duì)ARGs豐度的標(biāo)準(zhǔn)化總效應(yīng)。
結(jié)果 城市綠地ARGs表征 利用HT-qPCR技術(shù)，在所有草葉層和土壤樣品中分別檢測(cè)到217個(gè)和218個(gè)獨(dú)特的ARGs和MGEs。土壤中ARGs的歸一化相對(duì)豐度顯著高于草葉層(配對(duì)t檢驗(yàn)，P < 0.05)(圖1A)。基于Bray-Curtis距離的PCoA(圖1B)顯示，草葉層中的ARGs聚類在一起，并沿PCo1和PCo2與土壤中的ARGs分離，這分別解釋了ARGs方差的13.30%和17.50%。這一結(jié)果表明，土壤中ARGs的總體分布不同于草地葉層中ARGs的總體分布，Adnois試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)(P < 0.01)。 檢測(cè)到的ARGs包括所有三種主要的抗生素耐藥機(jī)制，其中外排泵是主要的耐藥機(jī)制(圖2A)。根據(jù)基因產(chǎn)生耐藥性的抗生素類別，作者將ARGs分為八種類型，即氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、氯霉素和安芬尼可(FCA)、大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈菌素B (MLSB)、多藥、四環(huán)素和萬古霉素耐藥基因。多藥耐藥基因是最豐富的ARGs類型，分別占草葉層和土壤總豐度的43.91%和52.22%(圖2B)。第二種和第三種最豐富的ARGs在草葉層中是四環(huán)素(24.58%)和氨基糖苷類(11.90%)，而土壤中則是MLSB (18.50%)和β內(nèi)酰胺酶(12.30%)(圖2B)。 檢測(cè)到的8個(gè)MGEs，包括6個(gè)轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座酶基因、1類整合子整合酶基因(intI1)和臨床1類整合子整合酶基因(cintI1)。由于MGEs在通過水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)傳播ARGs中的重要作用，使用普通最小二乘法(OLS)回歸模型確定了ARGs和MGEs豐度之間的關(guān)系。在草葉層(R= 0.568，P < 0.01)和土壤(R= 0.673，P < 0.01)中觀察到ARGs和MEGs的豐度呈正線性關(guān)系(圖3)。除了總MGEs的豐度之外，在草葉層樣品(R= 0.345，P < 0.01)和土壤樣品(R= 0.664，P < 0.01)中，ARGs的豐度和臨床1類整合子整合酶基因(intI1)之間的關(guān)系也保持不變(圖3)。 圖1. 基于草葉層和土壤樣品中ARGs的相對(duì)豐度確定抗性基因的分布。（A）樣品中檢測(cè)到的ARGs的相對(duì)豐度的箱線圖 。（B）基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)，顯示樣本中ARGs的分布規(guī)律。 圖2.（A）根據(jù)抗性機(jī)制對(duì)在草葉層和土壤中檢測(cè)到的ARGs進(jìn)行分類。（B）ARGs產(chǎn)生耐藥性的抗生素。 圖3. 利用普通最小二乘法(OLS)回歸分析了草葉層和土壤樣品中ARGs相對(duì)豐度與總MGEs和臨床1類整合酶基因(cintl1)的關(guān)系 城市綠地微生物群落特征 在草葉層中，OTUs被分為35門115綱。變形菌是最豐富的門，占細(xì)菌總序列的77.14%(圖S3)。第二和第三豐富的門是擬桿菌(18.04%)和放線菌(2.96%)(圖S3)。土壤方面，OTUs被分為45門141綱。放線菌(41.58%)和變形菌(30.64%)是前兩個(gè)優(yōu)勢(shì)門，其次是酸菌(10.94%)(圖S3)。土壤中細(xì)菌α多樣性顯著高于草葉層(配對(duì)t檢驗(yàn)，P < 0.001)，這一點(diǎn)已被Chao1和Shannon指數(shù)(圖4A)所證實(shí)。基于Bray-Curtis距離的PCoA揭示了草葉和土壤之間細(xì)菌分布的顯著差異(圖4B)。土壤樣品很好地聚類在一起，并沿PCo1軸與草葉層樣品分離開，這解釋了總方差的11.03%。 圖4.（A）細(xì)菌alpha多樣性在草葉層和土壤樣本中，***表明P < 0.001（配對(duì)t檢驗(yàn)）。(B)基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)，顯示了在草葉層和土壤樣本中細(xì)菌群落(beta多樣性)的分布模式。 圖S3. 草樣層和土壤中細(xì)菌群落在門級(jí)水平的組成 城市綠地中的核心耐藥基因和核心微生物群 在草葉層中，超過80%的樣品共同享有33個(gè)基因，占抗性基因總豐度的84.25%(圖5)。這些分布廣泛的基因被定義為草葉層核心耐藥基因。這類基因主要由多藥和四環(huán)素抗性基因和MGEs相關(guān)的基因組成(圖S4)。在土壤樣品，沒有鑒定出核心耐藥基因，因?yàn)橹挥腥齻€(gè)基因(cintI1、oprJ和oleC)被超過80%的樣品共享(只占ARGs總豐度的< 25%)。城市綠地中的核心微生物群也已被鑒定。對(duì)于草葉層，13.59%的屬在> 80%的樣品中共享，占總序列的97.78%（圖S5）。對(duì)于土壤，24.90%的屬在> 80%的樣品，占總序列的96.22%(圖S5)。 圖5.ARGs在草葉層和土壤中的分布頻率 圖S4.草樣中核心抗性基因的分類分布
圖S5.草樣和泥樣微生物群落在屬水平上的頻率分布 城市綠地中人類活動(dòng)因素與耐藥基因組的相關(guān)性 總的來說，工業(yè)因素與土壤耐藥基因的相關(guān)性比與草葉層耐藥基因的相關(guān)性更強(qiáng)。無論是在草葉層還是土壤中，居住條件與耐藥抗性均無顯著正相關(guān)。結(jié)果表明，工業(yè)因素與耐藥基因呈顯著正相關(guān)。例如，在草葉層中，電、氣、水和廢物服務(wù)的數(shù)量以及制造業(yè)的數(shù)量與耐藥基因相關(guān)性顯著(P < 0.05)，分別與總ARGs和FCA抗性基因的豐度呈顯著正相關(guān)(表1)。對(duì)于土壤，所有工業(yè)因素與總ARGs(P < 0.01)和氨基糖苷類耐藥基因(P < 0.05)的豐度呈顯著正相關(guān)。此外，制造業(yè)的數(shù)量和電力、天然氣、水和垃圾回收設(shè)施的數(shù)量顯著(P < 0.05)，并且與各種類別的ARGs(包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、多藥和萬古霉素抗性基因)的豐度呈正相關(guān)。 城市綠地耐藥基因的多重驅(qū)動(dòng)因素 結(jié)果表明，多種因素可能影響城市綠地的耐藥基因分布。因此，作者使用隨機(jī)森林模型來識(shí)別兩種樣本類型中ARGs豐度的主要預(yù)測(cè)因子。MGEs和細(xì)菌豐度是草葉層ARGs豐度的兩個(gè)最重要的驅(qū)動(dòng)因素(圖S6A)。MGEs的豐度是土壤中ARGs豐度的最重要驅(qū)動(dòng)力，而人類活動(dòng)因素對(duì)ARGs豐度有不可忽視的貢獻(xiàn)(圖S6B)。 結(jié)構(gòu)方程模型（SEMs）被用來進(jìn)一步探索多因素與ARGs豐度之間的偶然關(guān)系。SEMs分別解釋了草葉層和土壤中ARGs含量的28%和63%的差異(圖6)。在草葉層和土壤中，MGEs的豐度是形成ARGs分布的最主要的積極因素(圖6)，這與隨機(jī)森林分析一致(圖S6)。SEMs最重要的發(fā)現(xiàn)是，即使在考慮多個(gè)因素的情況下，工業(yè)因素對(duì)草葉層(λ = 0.14，P < 0.01)和土壤(λ = 0.15，P < 0.01)中ARGs的豐度也有直接的積極影響，這與Spearman’s ranked相關(guān)性檢驗(yàn)一致。
圖6. 結(jié)構(gòu)方程模型(SEMs)顯示了多種因素對(duì)草葉層(A)和土壤(B)中ARGs豐度的直接和間接影響。箭頭旁邊的數(shù)字是標(biāo)準(zhǔn)化的路徑系數(shù)。箭頭的寬度與路徑系數(shù)的強(qiáng)度成正比。R2表示由模型解釋的ARG豐度方差的比例。顯著性水平分別為**P < 0.01和***P < 0.001。標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)由結(jié)構(gòu)方程模型導(dǎo)出。
圖S6. 隨機(jī)森林預(yù)測(cè)值的重要性，通過城市綠地(A)草葉層和(B)土壤樣品中ARGs相對(duì)豐度的均方誤差增加百分比來衡量。 討論 城市綠地抗生素耐藥基因 在城市公園的草坪和土壤中檢測(cè)到多種ARGs，表明與公眾日常生活密切相關(guān)的城市綠地是抗生素耐藥性的研究熱點(diǎn)。在草葉層中發(fā)現(xiàn)了核心耐藥基因，但在土壤中沒有發(fā)現(xiàn)(圖5)。有兩個(gè)潛在的原因：(1)據(jù)報(bào)道，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育是包括土壤、飲用水和蔬菜在內(nèi)的不同環(huán)境中耐藥基因豐度的主要決定因素。SEMs證實(shí)，對(duì)于兩種樣品類型，細(xì)菌多樣性通過對(duì)MGEs豐度的直接影響間接影響ARGs分布(圖6)。與土壤相比，草葉層中細(xì)菌群落的多樣性較低，這可能是土壤和草葉層之間ARGs差異的主要原因(圖4A)。(2)與土壤微生物群相比，植物微生物群更容易受到周圍非生物條件如水分、溫度和輻射波動(dòng)的影響，這可能是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性發(fā)展的壓力因素。 MGEs介導(dǎo)的水平基因轉(zhuǎn)移(HGT)可能促進(jìn)ARGs在不同系統(tǒng)發(fā)育中的傳播。MGEs是攜帶ARGs的有效載體，例如，細(xì)菌可以使用1類整合子來儲(chǔ)存和表達(dá)外源抗性基因。在本研究中，城市公園的草坪和土壤中始終檢測(cè)到高多樣性的MGEs。我們的SEMs和隨機(jī)森林模型(圖S6)表明，MGEs是決定草葉層和土壤中ARGs豐度的最重要因素，這與OLS回歸模型一致，即ARGs豐度與MGEs豐度顯著相關(guān)(圖3)。這與之前的觀察一致，即葉層和根際是HGT的關(guān)鍵區(qū)域，因?yàn)樵谶@些區(qū)域細(xì)菌代謝率和流動(dòng)性高，細(xì)胞聚集和生物膜形成的可能性高。這些結(jié)果表明，HGT在城市綠地中傳播ARGs的潛力不容忽視。 工業(yè)分布決定了ARGs的分布 本研究在無點(diǎn)源污染的城市公園進(jìn)行，采樣點(diǎn)之間的溫度和降雨量等環(huán)境因素差異極小。因此，檢測(cè)到的各種ARGs可能受到人為影響的影響。值得注意的是，在草葉層和土壤中(圖3)均檢測(cè)到ARGs和cintI1基因的豐度之間的強(qiáng)相關(guān)性，后者被認(rèn)為是人類活動(dòng)影響的標(biāo)志。居住因素(人口密度和中等當(dāng)量家庭總收入)與草葉層或土壤中ARGs豐度之間沒有正相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)與朱等人最近的一項(xiàng)研究一致，該研究表明人口或國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值不是抗生素耐藥性分布的敏感指標(biāo)。然而，作者觀察到工業(yè)因素在很大程度上導(dǎo)致了城市綠地中ARGs的出現(xiàn)。SEM結(jié)果表明，工業(yè)因素對(duì)草和土壤中ARGs含量有直接和積極的影響。工業(yè)因素，特別是制造業(yè)和電力、天然氣、水和廢物服務(wù)的數(shù)量與氨基糖苷類、β內(nèi)酰胺酶、多藥耐藥基因和萬古霉素耐藥基因的豐度之間的顯著相關(guān)性表明，工業(yè)污染可能是城市綠地中這些類型ARGs的重要來源。 居住因素和工業(yè)因素對(duì)城市綠地耐藥基因影響差異的一個(gè)潛在解釋可能是城市生活垃圾和工業(yè)廢物在廢物處理過程中化學(xué)成分的差異。已經(jīng)證明，與城市垃圾相比，工業(yè)廢物的特點(diǎn)是金屬濃度高。由于ARGs和某些金屬抗性基因的潛在共同選擇過程，金屬污染通常與耐藥基因相關(guān)聯(lián)。在本研究中，所研究的城市公園都沒有直接的污水污染。因此，大氣中工業(yè)污染物的沉積，而不是工業(yè)廢水的污染，更有可能是工業(yè)分布對(duì)城市綠地ARGs分布影響占主導(dǎo)地位的原因之一。 結(jié)論 總之，本研究提供了城市綠地ARGs的綜合概況。結(jié)果表明，無點(diǎn)源污染的城市綠地是多種ARGs的潛在儲(chǔ)存庫(kù)。在草葉層中觀察到核心耐藥群體，但在土壤微生物群中沒有觀察到。我們發(fā)現(xiàn)工業(yè)因素是形成城市綠地耐藥基因分布的主要驅(qū)動(dòng)因素，也是導(dǎo)致ARGs水平升高的原因。這些結(jié)果拓展了我們對(duì)與城市居民日常生活密切相關(guān)的一般城市環(huán)境中ARGs分布模式的認(rèn)識(shí)，對(duì)管理與環(huán)境ARGs向人類病原體傳播相關(guān)潛在風(fēng)險(xiǎn)具有指導(dǎo)意義。
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