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編譯：無名者，編輯：謝衣、江舜堯。 原創(chuàng)微文，歡迎轉發(fā)轉載。 論文ID 原名：Dynamic Modulationof the Gut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model 譯名：噬菌體對小鼠腸道微生物群和代謝的動態(tài)調控 期刊：Cell Host &Microbe IF：15.753 發(fā)表時間：2019.6.12 通訊作者：Pamela A.Silver&Georg K. Gerber 通訊作者單位：哈佛大學、哈佛醫(yī)學院 實驗設計 本文將十種存在于人體內的兼性厭氧和專性厭氧細菌（Akkermansiamuciniphila, Bacteroides fragilis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus,Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Escherichia coli Nissle 1917, Klebsiellaoxytoca, Parabacteroides distasonis, Proteus mirabilis）定植于無菌小鼠中來構建明確微生物群落的限菌小鼠模型。在上述十種細菌中選取靶向四種細菌的裂解性噬菌體并引入限菌小鼠中，分別為E. coli 的T4噬菌體、C. sporogenes的F1噬菌體、B. fragilis的B40-8噬菌體和E. faecalis的VD13噬菌體。首先通過斑點試驗（spot assay）測試噬菌體對特定細菌的裂解特異性。然后將四種噬菌體兩兩成對（每對同時包含針對厭氧和兼性厭氧細菌的噬菌體），引入已構建好的限菌小鼠中，并在引入前后收集糞便樣品。接著，利用噬菌體特異引物進行qPCR估算噬菌體豐度，以16S rRNA擴增子測序獲得的相對豐度和使用通用16S rRNA引物通過qPCR測量的總細菌豐度（根據E.coli Nissle 1971標準曲線測量）的乘積來評估每種細菌在噬菌體引入前后的濃度。其次，根據上述已獲得的細菌豐度數據，利用R的vegan包來計算Bray Curtis相異度(dissimilarity)，評估噬菌體引入后小鼠體內微生物群的穩(wěn)定性。根據以上兩步來確定靶向菌群和非靶向菌群的豐度是否發(fā)生變化，并以此來推斷可能的級聯(lián)效應和菌群互作網絡。最后，制備上述小鼠糞便樣品以用于代謝組分析。樣品分為五等分，四個等分用于不同條件的分析，一等分作為備用，利用UPLC-MS/MS經過與標準品比較來鑒定和定量化合物，分析各代謝物的動態(tài)變化。 實驗結果 1.噬菌體對代表性人體腸道共生菌具有個體特異性 我們首先利用十種常見的人體腸道細菌定植于無菌小鼠中，構建模擬人體腸道微生物群落的模型。其次選取捕食其中四種細菌的噬菌體，測試噬菌體限菌小鼠共生細菌的裂解能力來驗證噬菌體特異性。使用斑點試驗（spot assay），測試了每種細菌對5毫升相應裂性噬菌體的敏感性(~109 pfu/毫升)。在37℃需氧或厭氧培養(yǎng)后，我們發(fā)現T4噬菌體、F1噬菌體、B40-8噬菌體和VD13噬菌體只靶向裂解相應細菌，對其他共生細菌沒有明顯影響。 2.噬菌體在哺乳動物腸道中捕食并與靶向噬菌體共存，導致敏感和抗性細菌的混合種群。 通過qPCR和高通量測序的方法，我們獲得了在噬菌體施加前后，噬菌體和細菌種群的數量濃度變化。分析表明，噬菌體和它們相應的共生菌共存于腸道中。引入噬菌體4-6h后，每種噬菌體都可以檢測到并在以后實驗中持續(xù)存在（圖1B）。先前的研究表明，在沒有敏感細菌的情況下給無菌小鼠注射的T4噬菌體，在兩天內就會脫落。鑒于此，我們感興趣的是確定在定植于小鼠的細菌是否獲得了對噬菌體的抗性。因為細菌群落既含有多樣性的菌株也包含密切相關的菌株，從糞便中分離單個菌株來測定噬菌體抗性是困難的。然而，使用選擇性培養(yǎng)基，我們能夠從糞便中分離E. faecalis，并測定其對VD13噬菌體的敏感性。如圖1C所示，在噬菌體引入前(27.1天)和之后 (30.5天)，E. faecalis對噬菌體是敏感的(敏感性極限，1.6%)。然而，在2天(32.3天)和10天(40.2天)后，發(fā)現分別有28%和68%的被測菌落產生噬菌體抗性。當與E. faecalis 濃度的變化一起考慮時，表明噬菌體定向敲低（knockdown）細菌(~ 2個數量級)導致抗噬菌體亞群的富集。 3.噬菌體在微生物群中誘導非靶向細菌的級聯(lián)效應 通過縱向跟蹤每種細菌發(fā)現噬菌體不僅影響靶向菌群還導致噬菌體不敏感的細菌物種數量變化。當根據估算的菌群濃度檢查細菌組成時(圖2A)，發(fā)現引入噬菌體會導致微生物群中低豐度和高豐度的細菌發(fā)生轉變。為了量化加入噬菌體后細菌定殖情況的變化，我們計算了每種噬菌體施加后與前一天相比細菌群落濃度的變化（圖2B）。我們發(fā)現，在第一組噬菌體施加期間，C. sporogenes和E. coli 的敲低導致B. vulgatus，P. mirabilis和A. muciniphila 快速繁殖，然后是P. distasonis 和B. ovatus種群的擴大，以及B. fragilis數量的逐漸減少。第二組噬菌體對微生物組的影響不顯著，E. coli 和C. sporogenes的擴張程度最小，其他物種在基線附近波動。根據Bray-Curtis差異度（dissimilarity），我們發(fā)現隨著噬菌體加入，小鼠之間和相鄰時間點之間的差異度逐漸縮小。這間接地表明微生物群在形成一個更穩(wěn)定的系統(tǒng)，噬菌體捕食可能有利于細菌群落的穩(wěn)定性。 圖2 噬菌體對共生腸道菌群的影響。(A)估計的糞便中的細菌數量，下圖是上方全尺寸圖的放大版本。來自單獨飼養(yǎng)小鼠(n = 5)的每種細菌估計的細菌濃度的幾何平均值顯示在堆疊條形圖中，y軸為線性刻度。(B, C)每種細菌物種的豐度取對數 (log10)，數據來源于圖2A，由引入第一組噬菌體(B)和第二組噬菌體(C)而產生的變化。x軸代表噬菌體引入后經過的時間，垂直虛線表示當噬菌體施加時t = 0。 4.噬菌體靶向細菌的缺失實驗描述了細菌相互作用的因果關系 我們通過比較有無靶向噬菌體引入下小鼠體內菌群定殖情況，揭示其對微生物群可量化的影響。如圖3A中，當物種1存在（完全聚生體, full consortium）和物種1不存在時 (細菌缺失，bacterial dropout)，可以洞察其對其他微生物的促進和抑制作用。噬菌體捕食導致進一步細菌敲低，其效果接近細菌缺失。因此，選用聚生體中九種細菌來定殖無菌小鼠，依次缺失每種噬菌體的靶向細菌(圖3B)。如圖3C所示，盡管在定殖過程中總體平均細菌密度相似，但每一組小鼠都顯示出顯著的組成差異。在某些情況下，噬菌體敲低可以與細菌缺失效果類似，例如T4噬菌體，在引入后會立即顯著減少E. coli 的數量。如假設的互作網絡所示(圖4A)，E. coli 很可能通過細菌相互作用促進B. fragilis并抑制B. vulgatus，因此其被第一組噬菌體敲低會導致B. fragilis的減少和B. vulgatus的增多。在施加第二組針對E. faecalis和B. fragilis 的噬菌體后，我們發(fā)現對周圍微生物群落的定殖影響相對較小(圖2C)。因此，引入第二組噬菌體會同時降低這兩種被噬菌體捕食菌群，這可能抵消抑制或促進的效應，導致對整個細菌集合定殖的影響忽略不計。總之，這些結果表明細菌種群噬菌體之間存在著廣泛且深入的相互作用。 圖4 腸道微生物群中細菌的相互作用網絡。假設的相互作用網絡來源于完整的10中細菌之間的定殖差異和長期定殖后噬菌體靶向細菌的脫落(第16.1天)，如圖3D所示。(A，B)代表E. coli與C. sporogenes (A)E. faecalis與B. fragilis(B)的相互作用網絡。線寬對應于細菌脫落誘導的定殖密度變化，即log10變換，實線終止于箭頭，表示假設的促進作用，虛線終止于正交線，表示假設的抑制作用。(C，D)在施用第一組噬菌體(T4和F1)，分別靶向E. coli和C. sporogenes (C)后，和施用第二組噬菌體(B40-8和VD13)，分別靶向B. fragilis 和E. faecalis (D)后，在選定的時間點(0.3天、2天和13天)，來自完全聚生體(來自圖2的數據)定植的小鼠的每種物種濃度的log10變換。條形代表平均標準差。 5.噬菌體誘導的細菌調節(jié)影響了腸道代謝組 我們試圖通過腸道代謝組的變化來描述噬菌體捕食對微生物組的功能效應。使用非靶向代謝組學，我們研究了小鼠不同階段的糞便代謝物，即在無菌狀態(tài)下，引入細菌定殖后和施加噬菌體后（圖5A）。結果表明，噬菌體誘導的腸道微生物組重建對代謝物的影響較小。第一組噬菌體的引入導致17%的化合物發(fā)生顯著的變化，這些代謝物幾乎存在于所有的KEGG途徑，例如，氨基酸、肽、碳水化合物、脂質、核苷酸、輔因子、維生素和異生物質(圖5B)。第二組噬菌體的對代謝產物數量方面沒有較大的影響 (圖5C)，微生物群落的變化主要是施加噬菌體13天后E. faecalis 的減少(圖5E)。相比之下，將細菌引入無菌小鼠后，糞便代謝組發(fā)生了廣泛的變化，所有KEGG途徑中共860種代謝物中的60% (514種代謝物）增加，15% (127種代謝物)減少。這些結果表明代謝組學受影響的程度反映了腸道微生物群組分變化的程度。 6.噬菌體可以調節(jié)與特定細菌特有的神經遞質代謝物 我們觀察到，噬菌體對細菌的特異性會減少相關的代謝產物。例如，色胺是一種通常來源于植物的神經遞質，但也可以由少量的共生腸道細菌通過色氨酸脫羧途徑產生。到目前為止僅在兩個具有遺傳特征的物種中被鑒定，即R. gnavus和C. sporogenes，后者存在于我們定殖的細菌聚生體中。在第一組噬菌體施加期間，我們檢測到色胺分別在0.3、2和13天降低了10、17和2倍，如圖5F所示的氨基酸途徑所示。這分別對應于C. sporogenes 降低840倍、4倍和4倍(圖5D)。神經遞質酪胺是由E. faecalis通過酪氨酸脫羧（tyrosine decarboxylation）產生的。施加第二組噬菌體導致酪胺（tyramine）減少4、2.7和4倍(分別在0.3、2和13天)，如圖5G的氨基酸途徑所示。這相對應于E. faecalis 分別減少了1.3倍、9倍和42倍(圖5E)。色胺和酪胺分別與C. sporogenes和E. faecalis的獨特關聯(lián)表明噬菌體、細菌和代謝物之間存在明顯的因果聯(lián)系。 7.噬菌體可以通過已知的哺乳動物宿主效應調節(jié)與多種細菌相關的代謝產物 第一組噬菌體的引入增加了絲氨酸和蘇氨酸在糞便中的濃度。這兩種氨基酸是O-糖基化腸粘蛋白中最具代表性的氨基酸重要成分。我們還發(fā)現由于第一組噬菌體的施加，膽鹽也發(fā)生了顯著變化。哺乳動物產生的牛磺和糖結合的初級膽鹽會經過微生物轉化，包括膽汁鹽水解酶對氨基酸去結合和羥基類固醇脫氫酶的脫氫。第一對噬菌體對細菌群落的調節(jié)增加了去結合膽鹽，并減少結合膽鹽 (圖5F)。這表明膽汁鹽水解酶活性增加，我們發(fā)現這主要與細菌聚生體(B. fragilis, B. ovatus, B. vulgatus, C.sporogenes, E. faecalis, E. coli, P. distasonis 和P. mirabilis)有關。我們還檢測到兩種去結合次級膽鹽的增加，這兩種膽鹽在無菌小鼠中沒有檢測到，因此可能是微生物衍生的12-脫氫膽酸鹽和熊膽酸。前者由12a-羥基類固醇脫氫酶的活動產生，而后者由7a-羥基類固醇脫氫酶和7b-羥基類固醇脫氫酶連續(xù)活動產生。每種酶都與B. fragilis, C. sporogenes和E. coli 相關，這三種細菌在第一組噬菌體引入后減少。這部分結果表明微生物群的波動會導致與宿主生理活動相關化合物的變化。 討論 我們的結果表明，裂解性噬菌體不僅捕食靶向細菌，還通過級聯(lián)效應影響腸道中非特異細菌物種。我們的研究展示了一個動態(tài)的微生物群落，其中裂解性噬菌體與靶向細菌共存并特異捕食，然后通過影響微生物群的其他細菌，最終調節(jié)腸道代謝組。 根據先前的研究，雖然有人提出噬菌體對系統(tǒng)發(fā)育成分的影響微乎其微，但是先前所采用的NGS測序結果僅建立在“屬”水平上，這可能掩蓋了物種水平的變化。另一項研究利用無菌小鼠的結果表明，噬菌體引入會導致小鼠腸道微生物群組成發(fā)生改變。但是他們使用的是一系列不確定的噬菌體，無法在體外驗證噬菌體在細菌聚生體中的感染能力。并且他們以相對濃度而非絕對濃度跟蹤腸道菌群，這就很難研究清楚捕食過程中的直接影響和間接影響。通過噬菌體和細菌相互作用的體外驗證，我們可以將噬菌體靶向捕食細菌的影響和隨后通過微生物間相互作用對菌群的影響區(qū)分開。 雖然通常通過物種或菌株對細菌的特定影響來看待噬菌體捕食，但我們的結果考慮了細菌群落內細菌間相互作用和潛在級聯(lián)效應的重要性。盡管細菌間的相互作用顯然很重要，但鑒于目前可用的方法有限，在體內進行實驗鑒定和確認比較困難難。在分子生物學中，確認基因作用的一般策略是利用基因敲除來驗證功能喪失，然后通過將基因重新引入敲除來驗證功能獲得。我們的結果表明，噬菌體可以以級聯(lián)的方式為微生物群提供類似的功能。 選擇合適的噬菌體可以選擇性地調節(jié)某些菌群，同時將對周圍微生物群的級聯(lián)影響降至最低。例如，E. faecalis和B. fragilis捕食相應細菌引起微生物群落中最小的級聯(lián)反應。盡管在定殖密度上，E. faecalis (~105，每克糞便中的細菌數)和B. fragilis (~107，每克糞便中的細菌數）存在巨大的差異。一種可能性是先引入E. coli和C. sporogenes的噬菌體會抑制菌群對隨后施加的B. fragilis和E. faecalis噬菌體的反應。我們更傾向于另一種情況，即B. fragilis和E. faecalis的級聯(lián)效應部分地抵消，這可以通過我們從菌群缺失實驗中得到的細菌間相互作用網絡來解釋。低豐度物種也可以產生強大的影響，例如低豐度的Clostridium scindens抑制Clostridioidies difficile感染。我們的結果表明，這種影響可能發(fā)生在共生菌中。這就引出了一個后續(xù)問題，即這些細菌如何介導其在哺乳動物腸道生態(tài)系統(tǒng)的影響。除了交叉相互作用，抗菌肽、群體感應和營養(yǎng)競爭等直接相互作用以外，細菌還可以通過宿主來改變局部環(huán)境，例如通過炎癥。總的來說，我們的發(fā)現表明，具有適當的噬菌體可以作為研究微生物組動力學和相互作用的工具，提供持續(xù)的敲低或精確的瞬時擾動。 我們的結果還表明，腸道微生物組中的噬菌體捕食對哺乳動物宿主有潛在的影響，如腸道代謝組的調節(jié)來所示。由于微生物代謝物在介導細菌與哺乳動物宿主之間的相互作用中起著重要作用，噬菌體與微生物代謝物之間的聯(lián)系提供了一種可能的治療思路。其他細菌調節(jié)方法，如抗生素，可能對微生物代謝產生長遠和不可預測的影響。相比之下，噬菌體可以引發(fā)細菌靶向效應，例如，通過噬菌體對減少色胺的C. sporogenes 的捕食可以加速胃流動性，而捕食E. faecalis可以減少酪胺并誘導回腸收縮。盡管表征腸道微生物的代謝仍需要大量工作，但噬菌體定向細菌敲除可能是合理調節(jié)微生物代謝以達到治療目的的潛在途徑。 噬菌體和細菌的縱向跟蹤使我們能夠觀察噬菌體在腸道微生物群中的捕食動態(tài)。我們的發(fā)現之一是裂解性噬菌體在腸道中持續(xù)存在，被靶向的細菌經歷了敲低而不是缺失。過去的研究表明，在哺乳動物腸道中T4噬菌體可以與靶向細菌共存并以此繁殖數周。有趣的是，T4噬菌體和一種類T4噬菌體ED6在用E. coli 單一定殖的小鼠中僅共存一至兩天，而另一種靶向E. coli的裂解性噬菌體T7卻持續(xù)數周。綜上所述，這些結果表明背景菌群可能是通過細菌間的相互作用來維持噬菌體在腸道中繁殖和共存的。 之前已經有報道稱，由于遺傳或生態(tài)抗性機制，噬菌體不能完全根除靶向細菌。在本研究中，我們發(fā)現引入E. faecalis的噬菌體會導致在最初的一些噬菌體敏感菌株中出現噬菌體抗性突變。先前的工作表明Vibrio cholerae對其噬菌體遺傳抗性的產生與適應性受損相一致，允許敏感菌株持續(xù)存在，從而繁殖噬菌體。在體外和其他生態(tài)系統(tǒng)中已經觀察到類似的適合性成本抗性，這可以解釋為什么在人類腸道病毒中幾乎沒有觀察到細菌抗性和噬菌體捕食之存在協(xié)同進化。一些其他機制，例如細菌在物理上無法接觸噬菌體的生態(tài)抗性，也可以解釋為什么一些噬菌體敏感細菌會在腸道中持續(xù)存在。此外，體外研究表明，噬菌體在粘膜表面的擴散減少，與管腔相比，腸粘膜中的噬菌體感染動態(tài)可能發(fā)生改變，這可能解釋了B. fragilis噬菌體捕食的差異。與大腸桿菌相比，這些物種在腸道粘膜上具有更大的向性，而大腸桿菌通常在管腔中更多見 微生物的復雜性和多樣性及其在腸道中的相互作用對實驗提出了巨大的挑戰(zhàn)。每個人的腸道微生物組都是獨特的，通常是由無法培養(yǎng)且難以進行系統(tǒng)發(fā)育分類的微生物組成，且受到生活方式，藥物，飲食和環(huán)境因素的干擾以及哺乳動物宿主的相互影響。因此，要理解人類腸道微生物組的復雜生物過程，必須在還原人體腸道微生物組與實驗的可行性之間做出折衷。我們使用定殖有十種可培養(yǎng)并具有特征的人類共生菌株的遺傳近交限菌小鼠模型，包括適度的復雜性和細菌多樣性，同時將潛在的混雜變量降至最低。我們發(fā)現裂解噬菌體可以在腸道菌群中發(fā)揮重要作用，但這僅僅是它們潛在功能的一個方面，因為它們具有多種生活方式（例如，溶源噬菌體）、對不同細菌物種的感染能力、對細菌的潛在感染力和水平基因轉移。此外，盡管噬菌體通常在細菌物種之間具有狹窄的感染范圍，但是它們可以在相同物種的菌株之間顯示出廣泛的侵染性。因此，該領域的重要目標將是在常規(guī)小鼠或人群中開發(fā)在完整的微生物群的情況下表征噬菌體作用的方法。通過闡明噬菌體和腸道細菌之間的動力學關系，并簡化了腸道環(huán)境，我們的工作提供了一個在復雜條件下進行深入研究的框架，并以此闡明噬菌體，微生物群以及宿主健康與疾病之間的相互作用。 評論 人體腸道微生物群對人類的健康有著重要影響，腸道菌群失調可能會導致各類疾病。本文通過構建限菌小鼠模型，利用四種噬菌體定向裂解四種細菌來探究噬菌體與腸道細菌之間的關系以及細菌之間的相互作用和代謝調控。結果充分說明了噬菌體對靶向和非靶向細菌的影響，以及細菌之間的級聯(lián)關系。最后，分析了噬菌體引入后各類代謝化合物的改變。這為以后研究噬菌體在腸道中的作用提供了一個新思路，并為調節(jié)腸道微生物群和治療相應疾病闡明了一個新途徑。 原文網址：https:///10.1016/j.chom.2019.05.001 |
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