【原】綜述 | Crit. Rev. Biotechnol.：植物內生菌——揭開生物勘探實現可持續農業的神秘面紗

到2050年，全球人口預計將達到97億，為了養活迅速增長的全球人口，農業生產需要在全球范圍內提高產量以承受持續不斷的人口壓力。但由于各種非生物和生物脅迫，農作物生產正面臨著嚴重威脅。內生菌是可以促進植物生長（PGP）以及作為新型生物活性化合物的可持續庫存的生態友好型替代品。內生菌被定義為任何可以在植物組織內生長和繁殖的微生物，它們通常由植物招募，來源于種子或根際微生物群落，并與宿主植物建立聯系，構成植物微生物組的重要組成部分。據報道，植物與內生菌已共同進化了6000多萬年，并在維護陸地生態系統中發揮重要作用，這種互作關系為雙方都帶來了益處。長久以來，與內生菌群落及其在植物生命中的作用常被忽視，但當前植物微生物組研究已完全改變了這一現狀，且這些研究表明這些微生物群落更為靈活，并包含編碼有益于宿主植物新性狀的遺傳信息。內生菌通過對宿主植物進行預警，或使其免受各種脅迫條件的影響，對宿主植物的健康和適應性起著重要作用。幾乎所有的生態系統中都存在內生菌，它們通過引發免疫反應，產生抗氧化劑和抑制病原體生長來減少植物中的非生物和生物脅迫。由于內生菌對宿主的寶貴貢獻，人們一直在探索這種共進化機制，以期能夠找到涉及共生的關鍵因素，并追蹤這種進化關系的償還機制。最近許多代謝組學研究證實，與特定代謝物相關的內生菌基因通過產生吲哚乙酸、生長素和赤霉素之類的植物激素與PGP產生關聯，這些植物激素可作為害蟲和微生物病原的保護劑。內生菌多樣性、脅迫緩解作用及其代謝產物的產生，使其成為新型代謝產物的無限來源，其應用可以減少農藥和藥物在食品生產中的使用。因此，需要更多研究來解決群落組裝進程及其在植物內部和植物上發揮的作用，其中，破解定居在根，莖，葉柄和葉的各種微生物群之間和內部的相互作用，是探索內生菌微生物組調控的先決條件。宿主免疫系統，宿主基因型，環境參數，微生物與微生物的相互作用，土壤和養分類型等驅動因素控制和決定著內生菌群落的組成，其中，pH、營養驅動因素、溫度和氧氣的可用性是微生物群落組成的主要驅動因素。但是，關于脅迫環境下內生菌的多樣性，組成以及與植物的相互作用的信息很少，而隨著二代測序（NGS）的發展，基因組測序，宏基因組學，宏轉錄組學，代謝組學，微陣列和比較基因組學方法可能會為內生菌的生活史提供更全面的理解。最近，宏基因組學和NGS方法的發展使我們能夠對內生菌微生物組的多樣性和群落結構進行廣泛篩查，對根相關內生細菌群落的研究中最好的植物種類有：蘆薈、柑橘、小麥和擬南芥。此外，一些研究人員設計并使用了新的基于雙重基因組共生芯片的工具，研究了內生菌與其宿主植物之間的共生作用。植物和內生菌互作產生許多生物活性化合物，包括紫杉醇、苦艾素、煙曲霉酸、喜樹堿、石杉堿、印楝素和許多可用于醫藥、農業、生物降解、和生物修復等領域的化合物。

在這篇綜述中，重點闡述了內生菌的生活方式及其進入植物的機制，它們如何調節植物的免疫系統，以及在非生物和生物脅迫下影響宿主植物的基因型和表型表達。此外還討論了基因組學和其他各種組學方法在揭示復雜的宿主-內生菌信號串擾中的作用。

2. 內生菌：一種生活在宿主植物體內的生活方式

內生菌可以通過從土壤到植物的水平方法或通過種傳微生物的垂直方法進入宿主植物組織并定植，且內生菌的定植是一個被動過程。有研究證實優勢根際細菌蕈狀芽孢桿菌在缺乏競爭性細菌的無菌條件下無法在小麥根內定植，預示著定植是有一定條件的。內生菌的成功定植與友好型植物微生物互作關系息息相關：當內生菌進入宿主植物時，宿主植物便會識別它，并引發信號分子的串擾。植物分泌的根系分泌物（類黃酮等），可作為許多PGP微生物（包括內生菌）的化學吸引劑；脂低聚寡糖（LCO），稱為Nod因子，能活化叢枝菌根（AM）或叢枝菌根真菌（AMF）以及根瘤菌-豆科植物共生體系的共生途徑（CSP）；黃酮作為生物原料可以使根瘤菌成功定植在豆科植物根內；獨腳金內酯（SL）處理可刺激短鏈甲殼質低聚物的合成和釋放，從而刺激植物共生信號通路，并且有報道稱擬南芥的根分泌獨腳金內酯作為毛霉菌內生定植的信號分子；阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）是植物細胞壁蛋白中富含羥脯氨酸的糖蛋白（HRGP）超家族的高度糖基化成員，可在多個級別建立植物與微生物的相互作用，這些蛋白質在根部定植中起特定作用，通常充當微生物的引誘劑或驅避劑以及引導感染的發生。此外，由植物根系分泌的酚類化合物，有機酸，氨基酸，糖和一些次生代謝產物，可以選擇性地吸引內生菌。最新關于植物miRNA和基因表達研究表明，通路和基因的響應一定程度上取決于內生菌，大量研究證明，在根瘤菌或AMF之類的有益內生菌在定植植物過程中，植物的防御通路會下調，但茉莉酸（JA）/乙烯（ET）/水楊酸（SA）的信號傳導途徑與微生物無關。細菌內生菌固氮螺菌Azospirillum sp.B510可以誘導水稻的系統抗病性，此外，基因表達分析表明，ET對內生菌介導的水稻的系統性抗性（ISR）至關重要。GA信號通路會抑制共生作用，而在AMF定植過程中，miRNA（-E4D3Z3Y01BW0TQ-）上調并破壞了GA信號通路。此外，內生菌還利用其自身的防御機制來保護自己免受植物防御機制的侵害：植物的模式識別受體（PRR）無法識別內生菌的微生物相關的分子模式（MAMP）。與其他病原互作相比，植物針對內生菌僅激活相對微弱的暫時性防御；真菌內生菌會產生一種幾丁質脫乙酰酶，然后將植物受體無法感知的殼聚糖低聚物脫乙酰；內生菌還會通過產生某種類型的代謝物（具有抗氧化活性）來躲避植物產生的活性氧（ROS）或氧化爆發作用，如過氧化氫酶（CatA），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽 -S-轉移酶（GSTs）過氧化物酶（POD）和烷基氫過氧化物還原酶（AhpCs）。

3. 內生菌調節植物宿主對抗不同脅迫的基因型和表型表達

3.1 增強生物脅迫抗性

內生菌生活在宿主組織內且不致病，并有引起不同植物響應而抵御多種病原的潛力。當植物受到不同的環境脅迫時，內生菌會啟動信號防御機制，從而表達脅迫響應基因，增強胼胝質沉積和入侵前防御。內生菌可以通過下調脫落酸（ABA）顯著緩解脅迫，但ABA也會通過發出引起系統獲得性抗性（SAR）的信號而產生負面影響；在植物激素GA的合成中，內生菌阻礙了DELLA蛋白對植物生長促進信號的抑制作用（圖1）。另外，許多葉內生菌可調節宿主基因表達，從而影響宿主防御途徑和宿主植物的生理反應：水楊酸和JA是兩種不同的植物激素，它們通過激活植物防御系統對病原攻擊起著重要作用（圖1）。最近許多代謝組學研究證實，與特定代謝物相關的內生菌基因通過產生生長素、赤霉素之類的植物激素，或產生其他調控氮磷鉀有效性的化合物，與PGP產生關聯。例如，產生赤霉素的內生菌可通過JA和SA途徑增加宿主對入侵者的抵抗力；絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）級聯是各種細胞過程（如分化，生長，增殖，脅迫響應和死亡）的高度保守的調節劑，這些蛋白質級聯在各種非生物和生物脅迫響應中起重要作用；細菌內生菌可合成多種新興的有機化合物和抗真菌代謝物，對線蟲和植物病原微生物具有廣泛殺滅活性。內生菌保護宿主植物免受病原微生物損害的能力，鼓舞了揭示其主要機制的進程。有研究人員回顧并提出了植物內生菌與病原體之間三種特殊類型的保護性通訊：(i)直接抑制，主要是局限性的防御微生物作用（產生次級代謝產物，如抗真菌，抗菌和殺線蟲化合物），(ii)間接抑制，引發固有的植物防御（ISR和SAR）途徑，(iii) 占領生態位，內生菌比病原體能更迅速地在宿主植物中定植，導致營養資源耗盡，抑制病原體定植。最近一項研究表明，通過利用有益的內生細菌解淀粉芽孢桿菌YN201732參與煙草的系統性耐藥機制，可以有效控制煙草中的煙草白粉病；一種真菌內生菌，Hypoxylonrubiginosum通過產生抗真菌代謝物phomopsidin，有望對灰分病（Hymenoscyphusfraxineus）進行生物防治；從小麥內生的枯草芽孢桿菌EDR4菌株中分離出一種抗真菌蛋白，該蛋白可抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum.sp.），F. vasinfectum, F. graminearum,G. graminis var. tritici, B. cinerea, R. cerealis, 和Macrophomakuwatsukai.菌的生長。

內生細菌莫海威芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌定植水稻（Oryza sativa）后對真菌病原Fusarium proliferum, 輪枝鐮孢, F. fujikuroi, Magnaporthe salvinii, 和M. grisea表現出抗菌活性；有研究報道了黑胡椒根的內生細菌惡臭假單胞菌BP25通過產生一系列VOCs，抑制多種植物病原的生長，如：Pythium myriotylum, Phytophthora capsici, Athelia rolfsii, Rhizoctoniasolani, Gibberella moniliformis, Colletotrichum gloeosporioides和寄生線蟲（如Radopholus similis）；使用兩個內生細菌菌株枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在玉米種子中定植，可以產生抗真菌脂肽抑制單核鐮刀菌的生長；從野生開心果中分離出的內生細菌芽孢桿菌，泛菌，假單胞菌，嗜單胞菌和粘質沙雷氏菌顯示出對致病性細菌菌株假單胞菌假單胞菌和丁香假單胞菌具有積極的生物防治作用；枯草芽孢桿菌（Bera 71）通過產生抗真菌脂肽iturin抑制菜豆中引起goid病的Macrophominaphaseolina的生長；與zipziphoracapitata和貫葉連翹有關的內生細菌屬于無色桿菌，節桿菌，芽孢桿菌，腸桿菌，歐文氏菌，泛菌，假單胞菌，沙雷氏菌和嗜單胞菌，其中，穿孔桿菌（H.perforatum）與頭孢菌（Z. capitata）相比更具抗菌活性，并可以支持更多抗菌活性細菌群落的定植；在終極腐霉菌脅迫下，甜羅勒毛狀根培養物產生的分泌物吸引了一些列微生物群落定植在土壤根際，其中迷迭香酸在這一過程中針對多種微生物群落具有動態抗菌活性（表1）。由于種子制劑的問題，大多數用于促生和生物防治活性的內生制劑產品都是基于芽孢桿菌和木霉屬菌株，盡管基于假單胞菌的產品近年來也已商業化。

圖1 內生菌對非生物和生物脅迫的響應

表1 內生菌在緩解生物脅迫中的作用

3.2 增強非生物脅迫抗性

內生菌群落模式是指內生菌群落的基本原理概念，以及驅動群落結構形成的力量，最初的內生菌微生物組結構及其組成類似于各自的種子庫，包括空氣和土壤，但隨著植物的生長和發育變得更具植物特異性。許多非生物脅迫，例如干旱、鹽度、極端溫度、堿度、氧化脅迫和重金屬毒性，都對農業生態系統構成威脅，內生菌會采用各種分子機制來減輕上述脅迫的影響。其中，各種膜受體（例如G蛋白偶聯受體（GPCR），受體樣激酶（RLK），離子通道和組氨酸激酶）可以感知到環境脅迫信號，這會改變細胞質中Ca2 +水平，并產生次級信使，例如ROS，ABA，肌醇磷酸酯（IPs）等，這些次級信號分子通過各種激酶（例如蛋白磷酸酶，蛋白激酶CIPK和CDPK）啟動蛋白級聯的磷酸化，通過磷酸化和去磷酸化的事件進一步激活不同的轉錄因子，如bZIP，DREB / CBF，MYC / MYB，AREB / ABF，WRKY等。這些轉錄因子導致各種脅迫響應基因的激活，包括編碼熱休克蛋白（HSP），脂質轉移蛋白（LTP），晚期胚胎發生豐富（LEA）蛋白，抗氧化劑，離子轉運蛋白和滲透壓蛋白的基因表達等，最終產生抵抗脅迫的能力并修復受到的損傷。因此，植物的抗逆性主要依靠由自由基（如ROS）的產生，以及通過脅迫響應基因表達產生抗脅迫的代謝產物。細菌內生菌對植物的生長潛在作用可通過幾種機制來解釋：其一，多種內生菌可以增加養分的可給性，例如氮磷或金屬元素，或產生可調節植物生長發育和防御反應的代謝物，例如生長素，GA，ABA，細胞分裂素，ET，SA，SL，油菜素甾體和茉莉酸酯等著名的植物激素。其二，許多內生菌會產生防御分子，例如脯氨酸，類胡蘿卜素和褪黑激素，它們對非生物脅迫具有防御作用，該作用不僅僅是局部的，內生菌也可以產生揮發性有機碳（VOC），這與宿主植物的初始識別/相互作用有關，也可以是主要信號分子的前體。其中，葡萄樹中褪黑素的積累是一個非常有趣的例子，接種解淀粉芽孢桿菌可以中和干旱，寒冷和鹽分脅迫的不利影響，該細菌菌株還減少了5-羥色胺N-乙酰基轉移酶和色氨酸脫羧酶轉錄上調；另一個例子包括宿主植物中類胡蘿卜素的產生，可作為植物激素，ABA或解毒酶（如ACC脫氨酶）的前體，這些酶控制ET的產生并隨后調節脅迫引起的損傷。當然，褪黑激素是一種強抗氧化劑，可增加CuZn SOD，抗壞血酸過氧化物酶，Fe-SOD和類囊體結合的過氧化氫酶活性，因此褪黑素因其較好的效果已經可以進行外源性應用，但產生褪黑素的內生菌進入植物組織，可能會對植物中的內源性褪黑素水平產生長期影響。其三，有報道稱ABA介導的氣孔運動之間存在串擾。ABA和ABA介導的信號傳導通路的生物合成通常是由植物根內相關微生物的存在才激活的，這些微生物介導的通路在鹽脅迫條件下有助于植物健康；當水稻接種內生真菌哈茨木霉菌后，水通道蛋白和脫水蛋白等基因的上調緩解了植物的非生物脅迫；枯草芽孢桿菌（BERA 71）可通過調節植物防御機制來提高鷹嘴豆的耐鹽性，而AM的定植可提高其抗旱性。

一些植物可以在重金屬和農藥污染土壤中生長，這些植物表現出幾種生理/遺傳策略來應對各種土壤污染物，它們可以招募有益細菌內生菌協助植物修復。一些細菌內生菌已進化出具有抵抗或耐受高濃度污染物的能力，同時表現出PGP特性：內生菌通過細胞外沉淀，生物轉化，細胞內積累以及將有毒金屬離子隔離成無毒或毒性較小的形式來減輕植物毒性（圖2）。重金屬抗性內生真菌屬于不同的分類，包括鏈格孢屬，毛霉菌，曲霉菌，生瘤菌，微孢子菌，劍孢菌和白孢菌；細菌包括芽孢桿菌，假單胞菌，關節桿菌，桿狀芽孢桿菌，彎曲桿菌，腸桿菌，梭狀芽孢桿菌，Leifsonia，葡萄球菌，Xanthomonadaceae，嗜麥芽單胞菌，Sanguibacte和微細菌。最近有研究從Zn / Cd超富集植物伴礦景天（Sedum plumbizincicola）中分離出許多內生細菌，選擇了五株表現PGP特性的菌株進行進一步研究，這些菌株對重金屬如Pb，Zn和Cd具有高耐受性，它們的PGP特性包括IAA的產生，磷酸鹽和磷的增溶，鐵載體的產生以及ACC脫氨酶活性。此后在盆栽試驗中測試了接種這些細菌后伴礦景天的生長情況及其在重金屬污染土壤中對Pb，Zn和Cd的吸收效果，發現與未接種菌株的植物相比，接種短小芽孢桿菌E2S2菌株大大增加了植物對Cd的吸收，并進一步增加了植物的芽和根長度，以及干重和鮮重生物量，因此，從伴礦景天中分離的內生細菌菌株增強了其植物提取能力，并且同時促進了植物生長。在銅脅迫下，苜蓿中華根瘤菌菌株CCNWSX0020增強了紫花苜蓿氮含量和生長指標，促進了植物根和芽中銅的積累，內生菌具有合成不同的“保護性”化合物（如抗氧化劑，碳水化合物和脯氨酸）以應對非生物脅迫的潛力，因此，苜蓿中華根瘤菌不僅促進了植物的金屬吸收和生長，而且在銅脅迫期間誘導了植物的抗氧化防御反應。此外表2中列出了其他內生菌在植物非生物脅迫中的一些例子。最后，在此領域中有一些研究空白需要重點關注：(i)關于內生真菌進行植物修復的信息較少，之前所有研究都集中在內生細菌協助植物修復上。(ii)盡管這些內生菌及其相關的宿主植物可以降解各種污染物，但大多數化合物通常降解緩慢或根本不降解。為了更好的利用內生菌，應改造并使用更多具有生物降解潛力的工程化內生菌。

圖2 內生菌調節植物修復

表2 內生菌在緩解非生物脅迫中的作用

4. 內生菌對植物免疫系統的調節

目前，找到并追蹤宿主植物內生菌的繁殖機制至關重要。植物與微生物互作通常會對植物健康和適應性產生有害或有益的影響，與內生菌共生賦予了宿主植物額外的防御機制；內生菌可以調節與防御有關的植物激素通路，進而定植在宿主植物中，并建立共生關系。植物與微生物之間的聯系會對宿主的免疫系統產生重大影響：多種菌根真菌和根瘤菌會引起植物的全身防御，分別稱為MIR（菌根誘導的抗病性）和ISR（系統誘導抗病性）。“誘導的系統抗性”是由生物或化學誘導物觸發的植物抗性狀態，可保護未受感染的部分組織免受病原微生物的侵害。內生菌進入宿主后，必須越過植物免疫系統高度復雜的第一道防線，該過程涉及保守分子的識別，叫作病原體或微生物相關分子模式（PAMP或MAMP）。肽聚糖，延伸因子TU（EFTu; elf18/26），脂多糖，鞭毛蛋白（Flg; flg22），細菌SOD，β聚糖細菌冷休克蛋白（RNP1motif），卵菌中的β-葡聚糖和幾丁質對MAMP的作用最大，這些MAMP被植物細胞表面的特異性受體分子PRR識別。與細菌內生菌相似，真菌內生菌也有特定受體，幾丁質受體（PR-3）可以識別真菌細胞壁上形成的幾丁質寡聚體。

內生菌也可以保護自己免受植物防御機制的損害。例如，真菌內生菌要么通過幾丁質脫乙酰基酶將其脫乙酰化為殼聚糖，要么將其覆蓋到其他分子中，從而掩蓋了幾丁質阻止自身被識別；內生細菌會產生其MAMP模式，使得宿主植物細胞表面上的PRR不能識別內生細菌，或者與病原體相互作用相比，植物的防御反應較弱；當葡萄與兩種不同類型的內生菌伯克霍爾德氏菌（Burkholderia phytofirmans）和細菌性病原體銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris））接觸時，對鞭毛蛋白（FLS 2）表現出不同的感知能力。在植物防御系統產生ROS的情況下，內生菌可以產生不同的抗氧化酶來實現自我防御（圖3）。

圖3 內生菌在調節植物免疫反應和防止氧化爆發中的作用機理

5. 使用多組學方法更好理解植物內生菌互作

全面了解植物與內生菌互作對于實現微生物群落的價值很重要，這些微生物群落是工業用酶，新型代謝產物和宿主植物緩解脅迫的來源。現代高通量基因組學研究揭示了內生菌的灰色領域，能夠對大量微生物進行測序，并通過分類學分類，系統發育和進化研究對微生物群落進行深入分析，從而徹底改變微生物組研究。全基因組分析可以揭示生物在有利和不利條件下（取決于植物的棲息地）生存狀態的所有相關信息，將微生物基因組與管家基因結合在一起可以分析對植物有益和內生生活方式必不可少的關鍵基因。全面了解內生菌的作用和對宿主的侵染機制可用于生物防治，PGP和植物修復方面，進而改善農業管理。完整基因組分析直接或間接揭示了內生菌的定植偏好性和不同生物活性的遺傳特征，這有助于鑒定與PGP機制，抗生素產生，抗生素抗性，內生分泌系統，插入元件，轉運系統，表面附著以及其他相關代謝機制有關的特定基因。全基因組還為深入了解內生菌的進化和生態學提供了方法：真菌內生菌蠟殼耳目由于其脅迫容忍和PGP潛能而備受關注，Pirifomosporaindica（蠟殼耳目）作為共生相互作用研究的模型，全基因組測序分析顯示了其作為植物益生菌制劑的潛力；編碼水解酶，N-酰基高絲氨酸內酯合酶，超黏附因子和富鐵酸抗性蛋白等基因的存在，強調了內生細菌泛菌的生物技術潛力。表3展示了已進行全基因組分析的內生細菌和真菌，這些內生菌可作為研究微生物-微生物和植物-微生物互作的系統模型。此外，單基因組測序改善了植物相關微生物的組學研究中的數據分析（微陣列，核心微生物組，NGS，比較基因組學，宏基因組學，蛋白質組學，代謝組學，宏轉錄組學和通量組學），比較基因組測序分析可深入了解內生菌行為。

二代測序分析可用于揭示蘆薈中不可培養的和可培養的細菌內生菌，以評估其微生物多樣性并闡明這些微生物在其宿主內的定植模式。宏基因組學方法與Insilco分析能揭示相關內生菌的新興的系統發育和功能：例如對健康和根結線蟲感染的番茄根進行比較分析得到相關微生物的群落結構和功能屬性差異；使用群落蛋白質組學可以鑒定定植在擬南芥葉中的內生細菌的排他性狀。但在將NGS技術用于實驗研究之前，應該了解它的局限性，主要是公共數據庫中存在高比例的沒有同源性的序列，從同一地點收集的樣品的基因組學研究將在很大程度上克服這一局限性。

微陣列技術為基于基因組的研究提供了分析內生菌基因譜的工具，與特定基因表達，共生宿主植物交流的研究以及其他轉錄組分析有關。對內生假單胞菌感染的擬南芥進行轉錄組分析顯示，ET響應基因下調表達，而與根瘤形成和植物激素產生有關的基因上調。為了研究共生相互作用開發了基于雙基因組的基因芯片工具，可以同時了解內生菌與宿主之間的相互作用以及雙方的基因表達模式。例如，使用Affymetrix基因芯片工具可以研究根瘤菌在根瘤形成期間的同步分化；用宿主植物信號分子木犀草素在富足和缺乏條件下培養苜蓿鏈球菌，檢測了關鍵調節蛋白（RpoN，NodD1和NodD3）的表達情況；同樣地也有研究分析了禾谷鐮刀菌分別在體外培養和感染植物時的基因表達情況；使用Aiptasia模型可以研究刺胞動物-共生藻之間的代謝相互作用。近來研究進化相關內生菌核心微生物組可以定義其在生態系統中的功能，有報道使用培養組學和16S rRNA基因測序方法，揭示了在中國9個不同地區生長的24種不同柑橘品種的內生核心微生物組。宏蛋白質組學和代謝組學可鑒定內生菌與宿主共代謝產生的蛋白質和代謝物，可得到宿主植物與微生物共代謝的最終產物，并作為可靠的生物標志物。2D-凝膠電泳可以獲得不同脅迫條件下目標蛋白的表達圖譜，可揭示內生菌在不同脅迫條件下的作用，有研究通過蛋白質組學的定量質譜分析方法從分子層面揭示了醋桿菌-甘蔗相互作用，分析的400多種蛋白質中有78種蛋白質差異表達。

多組學方法提高了診斷性和治療性生物標志物的識別和確定，并提供了可供驗證的假設。因此，為了將應用這些方法提出的各種假設進行驗證并揭開微生物影響宿主的機制，應設計高度簡便的實驗系統，以減少研究微生物與其宿主之間的交流的復雜性。應用多組學方法還可以探索內生菌在生產新型生物活性化合物中的作用，需要更多現代組學技術方法來研究內生菌生物學及其在宿主生態學中的假定作用。

表3 已進行全基因組測序的內生菌列表

6. 內生菌是生物活性化合物的珍貴寶庫

代謝組學分析表明，內生菌是生物活性化合物的寶庫。內生菌因其具有生物活性代謝物的生產潛力，對植物健康和適應性的貢獻，對各種脅迫的保護，植物促生以及其異源生物降解能力而聞名。從內生菌中提取這些代謝物受到許多因素的影響，例如它們的地理位置，氣候條件以及不同的樣品采集季節。內生菌分泌的次級代謝物通常分為不同的功能組，例如：類黃酮，生物堿，酮，類固醇，苯并吡喃酮，酚酸，皂角苷，醌，丹寧，黃原酮，四氫萘酮和萜類化合物，這些次級代謝產物包括一系列化合物，例如：殺蟲劑印楝素，抗生素，抗癌雙吲哚生物堿，抗微生物和抗分枝桿菌化合物以及殺蟲化合物。之前研究多集中于從內生真菌中分離和表征生物活性化合物（表4），但各地的草藥植物相關內生細菌，可以作為天然產物和治療化合物的貯藏庫，用作新型生物活性劑并減少氧化應激。內生菌還合成了幾種胞外水解酶，例如：酯酶，蛋白酶，纖維素酶和脂肪酶，以增強對不同植物入侵的抗性。內生菌可以產生抗生素化合物，例如：氨芐西林，奧沙西林，沒食子酸，頭孢氨芐和兒茶素，并具有殺菌活性。內生菌與植物之間的共進化產生的聯系已極大影響了次生代謝產物（即植物中的生物活性化合物）的生成，此外內生菌與其宿主植物的相互作用極大地影響了宿主植物的生理作用，這些變化包括沉默基因簇的激活，導致新的次級代謝產物的產生：內生細菌假諾卡氏菌屬通過激活細胞色素P450氧化還原酶基因和細胞色素P450單加氧酶的表達來誘導青蒿植物產生青蒿素；內生真菌紫杉菌和宿主紫衫互作產生紫杉醇，具有抗癌活性，對紫杉菌和紅豆杉基因組進行分析發現，它們紫杉醇生物合成所涉及的基因不具序列同源性，表明紫杉菌可能獨自進化出了特異的紫杉醇生物合成通路；此外，在某些條件下，微生物和植物中存在的同源基因簇可能被內生菌或宿主植物的脅迫誘導分子交叉激活。這方面研究已很多，但所涉及的機制尚不清楚。從內生真菌中提取的薯蕷皂元，長春堿，紫杉醇，金絲桃素，喜樹堿和鬼臼毒素等生物活性化合物，可用于制藥和農業領域。

表4 內生真菌產生的生物活性化合物

7. 內生菌在可持續農業生產中的作用

內生菌能進入并定植在植物內部組織，發揮各種益處增強植物生產力，但內生菌如何成功賦予植物這些良好的功能性狀？研究表明，內生菌可以幫助植物減輕非生物脅迫的不利影響，包括：通過產生生物活性代謝物、抗性相關基因表達以及酶代謝物的改變來應對水澇脅迫、高鹽、高溫、重金屬脅迫以及頻繁的干旱脅迫，此外，內生菌還可以產生抗真菌化合物來抑制植物病原生長。許多研究報道了內生細菌對小麥，水稻，油菜，番茄，馬鈴薯和其他農作物的促生潛力；在蠶豆，棉花，番茄，香蕉，豆類和咖啡植物中也可以使用內生菌控制害蟲危害；內生菌通過幫助植物獲取氮、磷、鐵和產生植物激素等營養物質來促進植物生長。真菌和細菌內生菌已發揮出巨大潛力，可作為農業生產系統中生態友好可持續的替代品。多項研究表明內生菌可以作為生物肥料，生物增效劑，生物刺激劑，生物農藥以及生物控制劑，在農作物生產領域中發揮著非凡的作用（圖4）。從藥用植物，森林，農業和紅樹林中分離出的內生菌（厚壁菌門相關）的代謝產物，具有促生和生防特性，通常，內生菌芽孢桿菌和放線菌會產生芳香族化合物，例如植物激素，多糖和脂肽，對于作物管理和PGP策略具有廣闊的前景。此外，放線菌可以產生具有抗腫瘤和抗微生物活性的代謝產物，可用于醫藥，獸醫和農業領域。然而，內生菌在農業系統中的最佳應用策略還需探索，最常用的方法是將內生菌作為拌種劑添加或直接添加到土壤中，但在野外田間使用這些接種技術不易成功。考慮到內生菌的生物學潛力及其在植物生長發育中的作用，需要更多探索以實現其環境可持續性，農業生產力的遠大目標，并作為與人類健康和工業部門相關的多領域新型生物分子的重要來源。

圖4 內生菌在可持續農業生產中的多重應用

植物可以作為微生物群落的“過濾器”成功招募特定的內生菌，內生菌是PGP的環保替代品，也是新型生物活性化合物的可持續儲存庫。持續增長的內生菌相關研究使其逐漸成為人們關注的焦點，大家逐漸意識到豐富的內生菌及其基因可提供共生相關和作用機理的知識，盡管如此，關于內生菌的生活方式和作用機制仍存在很多未知。只有大約1-2％的植物物種研究過其內生菌的作用，大多數來自陸地植物，而水生植物（湖泊，海洋等）相關研究尚未開展。由植物-內生菌產生的幾種重要的生物活性化合物可用于以下各個領域：醫學，農業，生物降解和生物修復。基于內生菌的納米粒子有望在將來藥物研發中發揮重要作用。為將利益最大化，需要開發基于內生菌的生物制劑，當直接應用于地上部分或種子部分時，這些生物制劑將更加有效，當微生物進入植物組織時，它將不會面臨根際微生物的競爭，而且，在植物內部的閉路系統中，代謝產物幾乎不會外散，宿主植物獲得的收益將達到最大化，這些生物制劑對于污染土壤的修復也非常有價值，因此，內生菌可以克服許多常規生物制劑的缺點。但是，為使這種生物制劑能在商業上取得成功，需要對以下方面有全面的了解：(i)建立宿主植物與內生菌之間共生聯系的策略，(ii)傳播方式，和(iii)植物與內生菌相互作用的分子和遺傳基礎。現在是時候將內生菌研究從生理學和生物化學提升到代謝組學和基因組水平了。迄今為止，還沒有專門針對內生菌及其代謝產物的數據庫，建立這樣的數據庫可能會解決許多科學問題，需要全面探索基因組學和植物-內生菌之間的新陳代謝，以從這種驚奇的互作關系中獲益！