【原】科研 | Nature：巨噬細胞源的谷氨酰胺促進衛星細胞活化和肌肉再生

巨噬細胞有助于修復受損的骨骼肌，它們可清除組織碎片并釋放刺激衛星細胞增殖的生長因子；隨后，它們再促進衛星細胞分化和組織血管再生。研究表明，巨噬細胞耗竭可損害肌肉組織再生能力。

為了誘導肌纖維死亡、炎癥和肌肉再生，我們在對照組小鼠和Glud1敲除小鼠中，將心臟毒素（CTX）注射到脛骨前肌或小腿部肌肉引起缺血。對照組和Glud1敲除小鼠在健康條件下和損傷后早期(注射心臟毒素后一天或結扎股動脈后三天)顯示出了相似的肌肉組織學(圖1A-e)。然而，與對照組小鼠相比，Glud1敲除小鼠的再生肌纖維數量高峰到達更早，肌肉壞死、細胞死亡、氧化損傷和炎癥的消退速度更快(圖1A-m)；注射CTX 6天后，Glud1敲除小鼠肌肉活力高于對照組。然而，在Glud1敲除小鼠中，早期再生的肌纖維較少，而晚期再生的肌纖維較大，這表明Glud1敲除小鼠的再生速度更快，再生程度更高(圖1n-p)。

圖1 巨噬細胞中GLUD1缺失促進衛星細胞激活和肌肉再生

a-d，（a）CTX注射后肌肉壞死；（b）再生；在第6天用蘇木精和伊紅（H&E）染色，顯示壞死（黑色虛線）（c）再生（黃色虛線）纖維（d），e，f，結扎后14天壞死（e）和再生區（f）。g-i，（g）CTX 注射后TUNEL染色顯示肌肉凋亡情況；CTX注射第6天的顯微照片（h）和結扎后(i).j，氧化應激由二氫鈦（DHE）染色CTX注射第6天后或結扎后14天。k-m，炎癥。（k）CTX注射后F4/80巨噬細胞浸潤；第6天（l）和結扎后(m）；n，CTX注射6天后肌肉活性（2，3，5- 三苯基-氯化四氧化二醇（TTC）染色）。o，p，CTX注射6天后（o）的早期再生肌纖維（左）和晚期再生肌纖維（右）代表性的顯微圖（p）。q，轉輪實驗（n=5）。r，s，Pax7（r）和Myog CTX注射后（s）的的肌肉提取物逆轉錄qPCR（RT-qPCR）；t，u靜止（pHH3^?）和增殖（pHH3）衛星細胞在Baseline和CTX注射后1天（t）或結扎后3天（u）代表性的免疫熒光圖，白箭頭：PAX7或PAX7+pHH3+細胞;黃色箭頭，Pax7+phh3^?細胞；V-x，PAX7（v）、MYOD（w）和MYOG（x）的肌肉提取物Westernblot。至少兩個獨立的實驗。應用非配對t檢驗、ANOVA）進行分析。數據以均值±s.e.m.表示。

在轉輪測試中，兩種基因型小鼠的基線物理活動及其在CTX注射后一天均下降，但是，Glud1敲除小鼠比對照小鼠更早恢復受傷前的身體能力（圖1q）。

然后我們通過檢測PAX7的表達評估不同基因型的衛星細胞基礎數量（圖1r-v），發現損傷后，Glud1敲除鼠中衛星細胞增殖更明顯和分化速度快（圖1r-x）。因此，Glud1敲除鼠中肌肉再生更為有效。

接下來，我們評估GLUD1缺乏如何影響巨噬細胞介導的免疫調節和血管生長。在Glud1敲除鼠中，早期的血細胞計數、肌肉中免疫和血管特征與對照組相似，兩種基因型的體外和體內募集試驗和巨噬細胞極化，以及傷口愈合和血管生成功能沒有差異。然而，在損傷后，Glud1敲除鼠中M2樣巨噬細胞較少，這表明在Glud1敲除鼠中，炎癥可以更快被清除并引發更高效的肌肉修復。

細胞內的代謝變化可以影響鄰近細胞的生物學。與富含谷氨酰胺相比，谷氨酰胺減少時，野生型巨噬細胞中谷氨酰胺的氧化降低73%（圖2a）。與野生型細胞相比，在兩種培養條件下，GLUD1敲除巨噬細胞中的谷氨酰胺氧化率均較低（圖2a）。而且，它們之間的總2-氧化葡萄糖酸鹽（2-OG）的水平也存在差異，可能是由于增強的檸檬酸循環增強（圖2b），從而彌補了谷氨酰胺衍生碳的缺失。

圖2 衛星細胞攝取巨噬細胞來源的谷氨酰胺促進肌肉再生

a，b，在谷氨酰胺(Q)豐富和谷氨酰胺降低條件下，谷氨酰胺氧化(a)和丙酮酸-羧化酶活性(b)；c,d,谷氨酰胺饑餓條件下(c)和L-蛋氨酸-S、R-亞磺胺(MSO)介導的GS抑制條件下(d)，骨髓巨噬細胞(BMDM)內外谷氨酰胺的水平；Western blots：BMDM中GS(e)和GLUD1(f)的水平；g,谷草轉氨酶(BCAT)、谷草轉氨酶(GOT)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性。h-j，總谷氨酰胺，[13C5，15N2]谷氨酰胺和[13C0，15N0]谷氨酰胺分別刺激C2C12細胞(h，j)和BMDM(i，j)，單獨接種或與[13C5,15N2]谷氨酰胺共培養(n=3)；k，l，注射CTX后1d (K)或結扎后3d(L)谷氨酰胺水平；m-o, CTX注射1天后谷氨酰胺和衛星細胞的增殖（m，n）和CTX注射6天后壞死（o）；p，野生型巨噬細胞(左)、間質谷氨酰胺(右)的谷氨酸向2-氧化葡萄糖(GLUD1活性；紅線)和谷氨酰胺向谷氨酰胺(GS活性；黑線)的轉化。U，酶活性單位；q、r、C2C12與BMDM共培養；s，Western blots檢測分離的衛星細胞中磷酸化p70S6K(注射CTX后1d)和磷酸化S6(注射CTX后3d)。t-y，用野生型和Glud1基因敲除骨髓重組的小鼠注射環磷酰胺后6天，免疫熒光染色(t)、EDU肌核(u)、MYOD核(v)、成肌細胞融合(w)、再生肌纖維面積(x)和壞死(y)情況；z，GPNA介導的SLC1A5抑制后，注射CTX后1d pHH3+衛星細胞數量。

雖然GLUD1敲除的巨噬細胞中的谷氨酰胺氧化作用有所減弱，但細胞內和細胞外谷氨酰胺的產生較多，這是由于GS活動增強（圖2c，d）。在蛋白質水平上，低谷氨酰胺條件下野生型巨噬細胞可誘導GS，但在GLUD1敲除的巨噬細胞中，GS活性更強（圖2e）。

GLUD1 將谷氨酸轉化為2-OG，GS催化谷氨酸生成谷氨酰胺。當谷氨酰胺水平較低時，野生型巨噬細胞中的GLUD1蛋白水平也上調（圖2f）；當谷氨酰胺缺乏時，野生型巨噬細胞中葡萄糖轉化為谷氨酸的能力增強，在GLUD1敲除的巨噬細胞中更是如此。在沒有GLUD1的情況下，巨噬細胞可通過增加分支鏈氨基酸氨轉移酶（BCAT）的活性使2-OG轉化為谷氨酸，或增加谷氨酸-牛甲酸酯轉氨酶（GOT）活性（圖2g）。但是，只有下調細胞質BCAT（BCAT1）時，GLUD1敲除的巨噬細胞才能將谷氨酰胺恢復到正常水平。

為了探究巨噬細胞源谷氨酰胺的去向，我們將C2C12肌細胞和巨噬細胞共培養。結果表明，與C2C12肌細胞單獨培養相比，野生型或GLUD1敲除的巨噬細胞共培養體系中肌細胞內總谷氨酰胺水平降低較低（圖2h）；在GLUD1敲除的巨噬細胞中，總谷氨酰胺的細胞內水平較高（圖2i）。因此，我們認為GLUD1敲除的巨噬細胞中谷氨酰胺生產超過谷氨酰胺的消耗量，從而增加了肌細胞的谷氨酰胺利用率。

在體內基線條件下，對照組和Glud1敲除鼠的肌肉中質谷氨酰胺的水平相似，但在損傷條件中下調（圖2k，l），而谷氨酸水平沒有變化。巨噬細胞中，GS耗盡可加劇損傷后谷氨酰胺短缺，Glud1敲除的巨噬細胞也無法維持谷氨酰胺的水平（圖2m）；同樣，巨噬細胞特異性的GS缺失會促進損傷后衛星細胞的增殖和肌肉愈合(圖2N，o)。因此，巨噬細胞GS在補充谷氨酰胺和促進衛星細胞激活以應對肌肉損傷方面發揮重要作用。

與上述數據一致，我們在低谷氨酰胺條件下培養野生型巨噬細胞。結果顯示谷氨酸向2-OG的轉化減少，而2-OG轉化為谷氨酸和谷氨酸轉化為谷氨酰胺的能力增強。我們又從CTX損傷的野生型小鼠的肌肉中分離巨噬細胞，結果顯示，隨著時間推移，GS活性逐漸增加，氧化GLUD1活性逐漸減少（圖2p，左），導致間質谷氨酰胺緩慢增加（圖2p，右）。GLUD1敲除鼠中，肌肉浸潤的巨噬細胞GLUD1活性更低，GS活性更高，可防止損傷后間質谷氨酰胺下降（圖2k）。

隨后，我們探討了巨噬細胞來源的谷氨酰胺對C2C12肌細胞的再生潛能的影響。為此，我們通過將C2C12肌細胞區分為富含谷氨酰胺和只含一定谷氨酰胺的培養基來觀察肌管的形成（圖2q，r）。在富含谷氨酰胺的培養基中，C2C12細胞與野生型巨噬細胞共培養可減少成肌分化；而C2C12細胞與GLUD1敲除巨噬細胞共培養可產生更多的肌管，這與培養基中谷氨酰胺的水平無關（圖2q，r）。C2C12細胞中敲除SLC1A5會減少谷氨酰胺的攝取，并抑制GLUD1敲除巨噬細胞促進肌細胞分化的作用。GLUD1敲除巨噬細胞培養基中增殖標志物PCNA和分化標志物myogenin表達增加，并以谷氨酰胺依賴的方式激活了mTOR通路。mTOR通路在衛星細胞的增殖和分化過程中發揮重要作用。mTOR抑制劑Torin2可抑制共培養體系C2C12細胞中PCNA和myogenin的表達。同樣，CTX注射Glud1敲除鼠，其衛星細胞中mTOR通路也增強（圖2s）。

在谷氨酰胺充足條件下，SLC1A5敲除衛星細胞的體外增殖和分化受到抑制。因此，我們向LSL-Cas9/Pax7^creERT鼠注射靶向slc1a5的gRNA AAV8顆粒，在該小鼠的PAX7⁺細胞中CTX誘導Cas9表達。從而使所有衛星細胞中SLC1A5選擇性下調60%。骨髓移植實驗表明，GLUD1敲除巨噬細胞能改善衛星細胞介導的小鼠肌肉再生，我們在CTX注射后24小時施用5-乙基-2-脫氧核糖核酸（EdU），并在5天后收集損傷的脛骨前肌。與野生型骨髓重組小鼠的肌肉相比，用Glud1敲除骨髓重組小鼠的肌肉顯示出更多EdU⁺終末分化的肌細胞核和MyoD⁺成肌細胞，并且再生肌纖維面積增加（圖2t-x）。相反，當衛星細胞導入谷氨酰胺的能力受到抑制時(使用靶向slc1a5的gRNA)，glud1敲除鼠的肌肉再生被抑制（圖2t-x）。

與肌肉再生的結果類似，在對照組小鼠和Glud1敲除小鼠中，接受非靶向gRNA治療的Glud1敲除小鼠組織損傷較輕，但SLC1a5 gRNA治療的Glud1敲除小鼠組織損傷較重(圖2y)。由于野生型衛星細胞的數量增加發生在CTX注射后的第2天到第4天(圖1R)，所以我們使用EdU治療了3天。EdU治療3天后，EDU⁺肌核的數量比24小時肌核的數量要多得多，當衛星細胞的谷氨酰胺轉運蛋白SLC1A5被抑制時，EDU⁺肌核的數量顯著減少。此外，我們還發現，SLC1A5抑制劑γ-L-谷氨酰對硝基苯胺(GPNA)對CTX處理的Glud1敲除鼠和野生型小鼠的衛星細胞增殖都有抑制作用(圖2Z)。綜上所述，衛星細胞攝取巨噬細胞源的谷氨酰胺在調控肌源性功能中具有重要作用。干擾該環節不僅能抑制Glud1敲除小鼠的肌肉修復，還能延緩對照組小鼠的肌肉再生。

眾所周知，再生功能會隨著年齡的增長而下降。與年輕小鼠相比，18個月大的對照組小鼠的肌肉重量指數降低，但Glud1敲除小鼠的肌肉重量指數下降不明顯(圖3a)，并且有更大的肌纖維(圖3b，c)，間質谷氨酰胺也存在同樣的趨勢(圖3d)。相對于年輕對照組小鼠，老年對照組小鼠中纖維化和巨噬細胞浸潤加劇，但在Glud1敲除小鼠中程度較輕(圖3e-g)，這表明慢性炎癥與肌肉健康呈負相關。總的來說，與18個月大的對照組小鼠相比，18個月大的Glud1敲除小鼠肌肉狀態較好(圖3h-j)。并且，Glud1敲除鼠肌肉中衛星細胞數量增加，但磷酸化p38⁺/磷酸化p38^-衛星細胞比率降低(圖3k-m)；這表明Glud1組小鼠中衛星細胞的自我更新能力較強。

圖3 巨噬細胞中GLUD1下調有利于受損和衰老的肌肉

a，腓腸肌重量。b、c,腓腸肌切片H&E染色，纖維面積定量(b)和H&E染色圖片(c)；d，脛骨內-前間質谷氨酰胺；e，f，Masson’s三色染色(f)測定老年小鼠小腿肌膠原蛋白沉積(藍色)及其定量(e)。幼年和老年小鼠小腿肌肉巨噬細胞浸潤情況。h-j，抓力測試(h)、轉桿試驗(I)和轉輪試驗(j)；k，脛骨內-前部衛星細胞密度；l，m，PAX7和磷酸化P38在衛星細胞中與老年小鼠趾長伸肌分離的肌纖維有關。注射CTX后6d或結扎后14d經R162介導的GLUD1抑制后出現肌肉壞死(n)，顯微鏡下可見缺血性壞死(o)；p，CTX注射后6d或結扎后14d巨噬細胞浸潤情況。q，CTX注射后1d pHH3+和pHH3?衛星細胞。r，CTX注射后1d，間質谷氨酰胺；s-w，腓腸肌重量(s)，脛骨內-前部衛星細胞密度(t)，間質谷氨酰胺(u)，轉桿試驗(v)，抓力測試(w)。

最后，我們評估了GLUD1抑制劑R162的潛在治療效果。結果表明R162治療可減輕肌肉壞死的情況和炎癥狀況(圖3n-p)，促進衛星細胞的增殖，并增加間質谷氨酰胺的水平(圖3q，r)。在18個月大的小鼠中，服用R162一個月可增加肌肉質量、衛星細胞數量和間質谷氨酰胺水平，并改善體能(圖3s-w)。而且，R162不影響體重或單個器官的重量。

肌肉組織是人體合成谷氨酰胺的主要場所。該研究發現肌肉損傷和衰老抑制了谷氨酰胺的供應，肌肉中浸潤的巨噬細胞感覺到了這種不足，從而減少谷氨酰胺的氧化，有利于谷氨酰胺的產生。巨噬細胞釋放的谷氨酰胺被衛星細胞攝取，通過激活mTOR通路促進其增殖和分化。與野生型巨噬細胞不同，GLUD1基因敲除的巨噬細胞預先適應了谷氨酰胺不足，因此，巨噬細胞的新陳代謝重塑有利于肌肉內環境穩態，以應對損傷。

在糖尿病、高膽固醇血癥和肥胖的患者中，血管阻塞和骨骼肌損傷的風險大大增加，而且，這些疾病在當今社會越來越普遍。同樣，在許多國家，隨著人口平均年齡的增加，肌肉減少癥的患病率也在上升。然而，目前幾乎沒有辦法改善與并發癥或年齡相關的肌肉問題。我們的數據揭示了一種治療病理性或年齡相關性骨骼肌萎縮的新方法。