【原】國人高分綜述 | Molecular Cancer：肝細胞癌中長非編碼RNA的機制與作用

編譯：思越，編輯：十九、江舜堯。

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1.LncRNA作為肝臟微環境和慢性肝病的調節劑

肝癌具有病毒感染，再生信號和低氧微環境等特性，這些特性為HCC細胞的增殖和存活提供了機遇和挑戰。LncRNA調節免疫反應，肝臟再生和氧化還原信號。在這些過程中，LncRNA的失調會導致慢性肝炎，肝臟過度生長和氧化應激反應，最終導致HCC的發生（圖1）。

（1）病毒感染

乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）是兩種主要引起慢性肝臟炎癥的病毒，未經及時治療會發展為HCC。肝炎病毒通過多種機制促進自身復制，其中之一是調節LncRNA的轉錄。HBV X蛋白（HBx）上調癌基因LncRNA-HUR1，阻斷p53以促進HCC生長，并下調抑癌LncRNA-Dreh，導致波形蛋白的重新表達，促進肝癌轉移。在病毒感染過程中，宿主免疫通常被激活。然而，肝炎病毒可以改變Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號，導致免疫反應缺陷。研究表明，HCV感染可上調IFI6、CMPK2和EGOT等LncRNA的水平，抑制IFN刺激基因（ISG）的表達，從而導致免疫抑制和慢性炎癥。

（2）肝再生

肝是部分切除或化學損傷后唯一再生的內臟器官。肝切除術后，由于尿激酶活性升高，肝生長因子（HGF）被釋放，從而激活EGFR和c-Met，使Wnt等多種信號增強以促進肝細胞增殖。增殖完成后，TGF-β抑制尿激酶和HGF的功能，從而使肝細胞回到靜止狀態。研究發現，LncRNA-LALR1、lncHand2等LncRNA參與該過程。一旦LncRNA失調，會誘導持續性的增殖信號轉導，常導致HCC的發生。這些LncRNA可能在沒有肝組織丟失的情況下被激活，或者不能被靜止信號TGF-β沉默。

（3）氧化應激

肝臟約占體重的2%，卻接受約25%的心輸出量。充足的血液供應對其氧需求是必不可少的，而供氧不足或抗氧化機制不足往往導致缺氧性肝損傷。飲酒、病毒感染、藥物解毒、代謝等多種危險因素會誘導活性氧（ROS）的積累，導致肝臟氧化應激。在缺氧位環境下，肝癌細胞通常促進血管生成，從而從血流中獲得額外的氧氣供應。HIF-1α被證明參與促血管生成過程。此外，研究發現，部分LncRNA對缺氧敏感（如linc-RoR），在缺氧應激下上調HIF-1α以支持肝癌細胞存活。相反， LncRNA LET等負調控HIF-1α的LncRNA，在HCC進展中下調。可能因為LncRNA LET使RNA結合蛋白NF90降解，導致HIF-1αmRNA失調。

2.肝癌組織中LncRNA的異常表達

表觀遺傳修飾、轉錄復合物招募和RNA加工是調節LncRNA生物發生的主要過程。LncRNA基因的表觀遺傳修飾可能遵循與蛋白質編碼基因幾乎相同的調控規律。在轉錄之前，LncRNA啟動子內通常包含激活染色質的標志，如H3K9和H3K27的乙酰化，H3K4的二甲基化或三甲基化。RNA聚合酶II被招募來啟動LncRNA的轉錄，通常，LncRNA基因傾向于與相鄰蛋白質編碼基因共享同一啟動子，通過5′端的甲基鳥苷帽、3′端的聚腺苷酸a尾和剪接內含子等經典途徑被加工為成熟LncRNA。部分LncRNA還可通過非經典途徑，如LncRNA MALAT1和MENβ被RNase P和RNase Z切割后，3′端形成三螺旋結構，在沒有poly（A）尾的情況下保護LncRNA 不被降解。

LncRNA的異常表達被證明與包括HCC在內的多種疾病發病機制有關。高通量測序顯示，與非癌性肝組織相比，HCC組織中LncRNA的表達譜明顯不同（表1），這些異常表達通常與抑制/促進LncRNA的表觀遺傳沉默/激活、促癌/抑癌轉錄因子對LncRNA的轉錄激活/抑制、使LncRNA具有致癌功能的特殊加工模式以及LncRNA與microRNA或蛋白結合從而影響LncRNA穩定性有關（圖2）

表1 部分失調LncRNA在肝癌發生發展中的作用

（1）表觀遺傳修飾

在HCC進展過程中，LncRNA基因的DNA甲基化和組蛋白修飾，使HCC抑制性LncRNA表達減少（圖2a）或HCC促進性LncRNA表達增加（圖2b）。研究發現，DNA甲基轉移酶DNMT1和DNMT3誘導抑癌基因LncRNA-MEG3的啟動子高甲基化，其表觀遺傳沉默導致肝癌細胞凋亡抵抗和肝癌生長。由于H3K27乙酰化作用增強使得linc00441過度表達，linc00441又使DNMT3A發生甲基化并使其鄰近基因RB1失活，從而促進肝癌細胞的增殖

（2）轉錄激活

已經證實，YAP、c-Myc和β-catenin等致癌轉錄因子在肝癌組織中過度表達，并啟動如LncRNA等非編碼基因的轉錄。在肝癌中檢測到增強的Myc信號，可能與被Myc調節的LncRNA（如linc00176）有關，進而導致肝癌細胞周期停滯和壞死。（圖2c）

（3）RNA加工

LncRNA轉錄本經過特殊處理，例如選擇性剪接（圖2d）等方式為肝癌的發生發展提供致癌作用。剪接因子MBNL3在胎兒肝臟和肝癌組織中高表達，被證明可誘導外顯子4包含LncRNA PXN-AS1，使得LncRNA PXN-AS1與PXN mRNA相互作用并防止其降解，從而導致肝癌發展。

（4）其他

LncRNA可作為競爭性內源性RNA（ceRNA）與miRNA結合，行使miRNA海綿的作用，影響miRNA靶基因的表達，而miRNA也會影響LncRNA的表達（圖2e）。miR-34a直接結合LncRNA-UFC1以降低其半衰期，從而抑制LncRNA-UFC1誘導的肝癌細胞增殖。部分蛋白質（如RNA結合蛋白RBPs）還可以結合LncRNA來調節代謝，并通過物理相互作用調節LncRNA的穩定性。

3.肝癌中LncRNA的功能機制

LncRNA可以通過與DNA結合、RNA相互作用、與蛋白質結合、產生小肽等途徑發揮調節作用。與DNA結合使LncRNA重塑染色質結構和表觀遺傳修飾，從而調節靶基因的表達；LncRNA作為分子海綿與mRNAs或miRNAs相互作用，從而調節mRNAs的穩定性和翻譯或miRNAs與自身靶點的結合；LncRNA能夠與蛋白質結合，調節其構象、定位或穩定性、蛋白質復合物的形成或解離；部分LncRNA含有小的開放閱讀框（SORF），編碼具有生物功能的肽參與HCC的進展。（圖3）

（1）DNA結合和染色質重塑

LncRNA在蛋白質編碼區或非編碼區通過順式或反式與DNA結合，調控基因的表達（圖3a）。LncRNA XIST通過與DNA結合，在早期發育過程中介導X染色體失活。典型的LncRNA-DNA相互作用位點可能位于某些基因的啟動子或其他調控DNA序列（如增強子）中，通過形成RNA-DNA雜交（R-loop）來改變染色質結構，進而提供信號來招募生物分子（如表觀遺傳修飾劑）來調節基因表達，或在空間上將啟動子和增強子/抑制子結合起來調節轉錄活性。LncRNA-Khps1直接與SPHK1基因啟動子相互作用形成LncRNA-DNA結構，招募組蛋白乙酰轉移酶p300/CBP激活SPHK1的表達。

在肝癌的發展過程中，發現存在表觀遺傳修飾劑的失調，如DNMTs、EZH2、HDACs、PCAF。研究發現，這些表觀遺傳修飾因子可以被肝癌中的LncRNA調節，從而導致表觀遺傳改變異常，如低甲基化、高甲基化。LncRNA-UPAT可以直接與UHRF1結合，從而保護UHRF1不被降解，促進HCC進展。

（2）mRNA和miRNA的海綿作用

miRNAs結合mRNAs來調節mRNA的轉換被證明是調控細胞事件的重要機制。LncRNA可與mRNA相互作用，調節mRNA的穩定性和易位；LncRNA也可發揮miRNA海綿作用，抑制miRNA與其自身靶點的結合（圖3b）。LncRNA H19包含兩個let-7 miRNA功能結合位點，通過與miRNA結合，從而促進靶mRNA Dicer和Hmga2的表達。LncRNA-miRNA的相互作用，有時是通過改變LncRNA自身的功能而影響細胞過程，而非改變結合的miRNA。LINC00673通過抑制SRC-ERK信號傳導發揮抑癌作用，A-G核苷酸突變為miR-1231提供了結合位點，從而miR-1231抑制了LINC00673的抑癌作用。

雖然在HCC中，存在UFC1等LncRNA通過與mRNA穩定蛋白HuR結合，從而穩定β-catenin mRNA，并激活Wnt信號促進HCC進展。但LncRNA更多的是通過對miRNA的調控，間接影響mRNAs的穩定性，而不是直接與mRNA結合。研究發現，miRNA在肝癌發展過程中大部分處于下調狀態，可能與miRNA加工過程的缺陷、pre-miRNA核受損、LncRNA介導的miRNA失調有關。LncRNA調控miRNA的機制主要有兩種，即表觀遺傳修飾和充當miRNA海綿。作為miRNA海綿時，LncRNA阻斷了miRNA與其靶基因之間的聯系，導致部分肝癌相關基因的重新激活。LncRNA-HULC作為miR-186的競爭性內源性RNA，上調HMGA2的表達以促進HCC生長。

（3）蛋白質相互作用與調控

LncRNA可以與蛋白結合，從而調節蛋白的定位和穩定性，以及通過作為支架的功能介導蛋白-蛋白復合物的組裝（圖3c）。LncRNA XIST在X染色體失活中起著核心作用，通過與LBR結合，引導失活的X染色體定位于核膜上，使XIST在X染色體上擴散，進而轉錄沉默。這可能與蛋白質與LncRNA的親和力改變引起。LncRNA HOTAIR可以與組蛋白修飾劑PRC2和LSD1結合，形成新的蛋白質復合物。相反，部分LncRNA可以競爭性地引起蛋白質復合物的分離。

在HCC的發病機制中，上述功能也發揮重要的作用。部分肝癌相關蛋白的亞細胞定位受到LncRNA的調控，LncRNA-MUF與AXNA2相互作用，促進其細胞質移位，進而激活WNT信號促進肝癌進展。 LncRNA還可介導癌蛋白和腫瘤抑制因子的穩定，LncRNA-PRAL促進p53與HSP90的相互作用，從而阻止p53與MDM2的結合，抑制肝癌生長。作為支架，LncRNA HOTAIR可與PRC2和E3連接酶Mex3b結合，促進PRC2的降解，誘導肝癌進展。LncRNA FTX可與MCM2結合，將其從染色質中分離，導致細胞周期停滯并抑制肝癌生長。

（4）編碼小肽

最近研究表明，部分LncRNA含有少于100個氨基酸開放閱讀框（sORFs），可以產生功能性肽段（圖3d）。隨著生物信息學和測序技術的發展，更多的之前認為是非編碼的轉錄本被鑒定為sORFs。有研究發現，位于細胞質中約40%的人類LncRNA可能被翻譯，但質譜分析只鑒定出很少的LncRNA翻譯產物，可能與小肽的快速降解有關。在肝癌發生發展中，有關LncRNA編碼的小肽的研究還很有限。可能與小肽的不穩定性、與已經注釋的蛋白不同源或沒有生物功能有關。

圖3 LncRNA在肝癌中的作用機制。（A）LncRNA通過與啟動子或遠端調控元件結合，與DNA相互作用，調控基因表達；（B）LncRNA與mRNAs結合調節其穩定性，進而調節基因表達；LncRNA還可作為分子海綿與miRNA結合，使miRNA靶向基因重新激活；（C）LncRNA作為支架與蛋白質相互作用，調節蛋白質穩定性或促進蛋白質復合物的形成；（D）部分LncRNA具有編碼小肽的潛能，通過小肽發揮其生物學功能。

4.LncRNA作為肝癌標志物中的意義

HCC相關的LncRNA通過不同的機制，促進或抑制HCC的發生，為HCC的治療提供治療策略（圖4）。

（1）維持增殖信號

細胞增殖通常由受體酪氨酸激酶（RTKs）的激活以及細胞周期進展共同決定。正常細胞限制其增殖以維持生物體的正常結構，而RTKs（如EGFR、c-Met、IGF1R和IGF2R）的結構性激活可導致肝癌等腫瘤的發生。此外，細胞周期檢查點異常也被證明與肝癌的發生發展有關。細胞周期由細胞周期蛋白及相關激酶調控，檢查點蛋白Cyclin D1, CDK4和CDK6的失調被證明與HCC細胞增殖呈正相關。在HCC中，lnc-EGFR、LINC01225等通過與EGFR互作用，導致其結構性激活，促進肝癌生長。LncRNA-UFC1與蛋白HuR結合，使β-catenin和CDK4/6、c-Myc、cyclin D1等檢測點蛋白的表達上調，導致肝癌細胞G1/S期轉化和增殖增強。（圖4a）

（2）細胞能量失調

癌細胞通過對代謝途徑重編程，以提供能量和構建所需元件。涉及的途徑包括有氧糖酵解、谷氨酰胺解、脂肪生成等。有氧糖酵解是癌細胞產生能量的主要方式，谷氨酰胺被裂解與NADPH的產生和細胞抗氧化機制相關，脂肪生成可促進膜生物合成和能量儲存。LncRNA被認為與代謝酶失調和HCC細胞異常能量模式有關（圖4b）。LncRNA TUG1能夠刺激miR-455-3p的轉錄，并下調AMPKβ2的蛋白水平，從而激活HK2表達，提高肝癌細胞的糖酵解能力。LncRNA HOTTIP上調GLS1的表達，從而促進肝細胞癌細胞的谷氨酸分解和增殖。ACSL1可產生用于脂質合成的acyl-CoAs合成酶，LncRNA-HULC通過激活ACSL1調節肝癌中的脂肪生成。

（3）影響腫瘤干細胞

干細胞具有無限復制和分化細胞的能力，對于肝臟的再生能力十分重要。但是，腫瘤干細胞（CSCs）是腫瘤治療的主要障礙，也是大多數腫瘤耐藥和復發的原因。CD133、CD24、EpCAM、ICAM-1等干細胞標志物，已證明在HCC的進展和耐藥中起著關鍵作用。Wnt/β-catenin、JAK-STAT和Hippo-YAP通路也參與HCC干細胞的維持。研究發現，LncRNA能夠在轉錄后或翻譯后水平上調節Wnt-β-catenin途徑，LncRNA-DANCR可以與β-catenin的mRNA結合以防止被miRNA降解。此外，LncRNA通過促進或抑制IL-6-STAT信號傳導，從而上調或下調HCC細胞株，LncRNA-DILC通過抑制IL6-STAT3途徑發揮抑癌作用，抑制HCC干細胞的增殖。不僅如此，lncBRM與BRM蛋白相互作用，促進BRG1嵌入BAF復合物的組裝，激活YAP1的表達（圖4c）。

（4）激活腫瘤轉移

腫瘤轉移導致大多數癌癥惡化。轉移始于上皮-間質轉化（EMT），隨后間充質樣細胞侵入血管，細胞對缺氧耐受并轉移到遠處的器官。研究發現，EMT過程和血管生成被認為是導致肝癌轉移的重要事件。部分LncRNA能夠調節EMT標記物的表達和血管形成，從而影響HCC轉移（圖4d）。LncRNA ATB和ZFAS1可以miRNA海綿作用，激活間充質ZEB1，促進肝癌的轉移。LncRNA ZEB1-AS1通過提高其啟動子活性刺激ZEB1的表達從而促進肝癌的轉移，而ZEB1-AS1低甲基化患者與高轉移復發和低生存率相關。此外，波形蛋白可以與LncRNA-Dreh相互作用，抑制HCC的發展。

圖4 LncRNA作為肝癌標志物的意義。（A）生長因子受體/RTK信號與細胞周期進展異常調控引起持續增殖；（B）代謝重編程引起能量失調；（C）CSC相關信號的過度激活導致干細胞升高；（D）間葉細胞樣標志物的過度表達與血管的形成增強腫瘤轉移。

5.LncRNA對肝癌的診斷和治療價值

肝癌的診斷主要依靠超聲顯像和AFP測定。但對于肝癌早期患者，以上檢測的靈敏度較低。目前，切除、肝移植等手術方法是早期肝癌唯一可行的治療方法，而晚期肝癌基本上無法治愈。

（1）LncRNA作為肝癌潛在生物標志物

與正常肝組織相比，大量LncRNA在HCC中異常表達。但是單獨使用LncRNA無法區別肝癌與其他肝臟疾病。目前常用LncRNA聯合其他分子，特別是肝癌標志物AFP進行聯合預測。除了AFP，miRNAs或mRNAs也可以與LncRNA聯合預測HCC。此外，液體活檢相比于組織活檢，是無創的理想診斷方法。LncRNA UCA1, WRAP53, PVT1和uc002mbe.2存在于體液中，LncRNA-HULC可在血液樣本中檢測到，并且可通過qPCR檢測。進一步研究表明，這些LncRNA來源微泡和凋亡小體等胞外小泡（ev）的分泌，可通過超速離心和過濾分離。

（2）LncRNA作為肝癌治療靶點

肝癌的預后總體較差，部分原因是因為缺乏治療靶點。肝癌中最常用的靶向藥物是靶向RTKs的索拉非尼，但也常觀察到耐藥性。LncRNA相比于比蛋白質靶向制劑具有設計簡單的優勢，主要包括反義寡核苷酸（ASOs）和RNA干擾（RNAi），通過靶向LncRNA對肝癌具有良好的抗癌活性。ASO介導的linc00210沉默被證明可以抑制HCC細胞更新和侵襲，并且RNAi敲除LncRNA-CASC9顯著減少HCC小鼠模型中腫瘤的形成。目前以肝癌為靶點的ASOs和RNAi的研究范圍很廣，已經應用于HBV的治療。此外，除癌基因LncRNA的敲除外，腫瘤抑制性LncRNA的遞送也是一種替代策略。

本文主要介紹了LncRNA在肝癌中的異常表達涉及的主要過程，并總結了LncRNA作為腫瘤抑制因子或致癌基因調控肝癌發生發展的機制。此外，還對LncRNA在肝癌中的診斷和治療潛力進行了總結。LncRNA正逐漸成為RNA生物學和腫瘤學研究的熱點問題之一。LncRNA通過調節其結合分子的表達、定位、穩定性、活性等特性，引起持續增殖、代謝異常、干細胞增多和轉移等一系列癌表型，導致肝癌的發生和發展，部分存在于體液中的LncRNA具有單獨作為潛在HCC生物標記物或與其他分子聯合提高特異性的價值。

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