項目文章｜熊果酸通過抑制NOX4/NLRP3炎癥小體通路和菌群失調逆轉肝纖維化

昵稱69125444 2021-11-03

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NOX4/NLRP3炎癥小體通路的激活與其他器官的纖維化有關。腸道細菌失衡是肝纖維化的重要驅動因素。2021年9月，南昌大學第一附屬醫院朱萱課題組在Gut Microbes期刊（IF:10.245）上發表了題為“Ursolic acid reverses liver fibrosis by inhibiting NOX4/NLRP3 inflammasome pathways and bacterial dysbiosis”的研究論文，旨在探討熊果酸（UA）抗肝纖維化作用是否與NOX4/NLRP3炎癥小體通路和腸道細菌有關，為今后的治療奠定基礎。文章中的微生物多樣性測序服務由歐易生物提供。

研究背景

肝硬化的一個共同特征是潛在致病菌的增加和有益細菌的減少。腸道微生物失衡會導致細菌易位，導致炎癥級聯反應，肝臟損傷甚至肝纖維化。NLRP3是一種廣泛參與細胞免疫的細胞內多蛋白復合物，可對有害信號作出反應，啟動修復反應。之前的研究表明NLRP3炎性小體激活與卵巢、腎臟和心臟纖維化相關。NADPH氧化酶4（NOX4）通過細胞凋亡和肝星狀細胞（HSCs）激活促進肝纖維化的關鍵因子。然而關于NOX4/NLRP3信號通路在肝纖維化中的作用研究甚少。

肝纖維化的發生發展與腸道細菌紊亂密切相關。已有研究表明NLRP3炎性小體能夠識別腸道細菌及其代謝產物，發揮腸道免疫功能，從而保護腸道。熊果酸（UA）通過抑制肝臟炎癥、選擇性誘導活化的造血干細胞凋亡和抑制造血干細胞增殖來減輕肝纖維化，但具體機制尚不清楚。由于NOX4和NLRP3炎性小體與許多器官纖維化的發生發展密切相關，這些因子也與腸道細菌的變化有關。因此，探索UA的抗纖維化機制是否與NOX4/NLRP3信號通路及腸道菌群調控有關，可以為今后的治療奠定基礎，對延緩肝纖維化的發展至關重要。

研究結果

1. 熊果酸（UA）逆轉肝損傷、肝纖維化和細菌易位

HE染色，Masson染色和Sirius red染色結果表明，UA處理顯著降低了CCl4對小鼠肝小葉結構、纖維間隔形成及膠原沉積的影響，炎癥細胞浸潤減少（圖1a，1c，1d）。ELISA結果顯示，CCl4組血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和羥脯氨酸水平較對照組來說顯著提高（P< 0.050）。然而，UA處理降低了這種效果（圖1b）。

圖1 UA可改善CCl4誘導的肝纖維化小鼠的肝損傷和肝纖維化

免疫組化結果顯示，在CCl4組的肝組織中α-SMA、Collagen-1等激活的肝星狀細胞（HSCs）標志物顯著高于對照組（P<0.050）。TUNEL染色結果表明，CCl4組肝細胞凋亡增加。然而，在UA組中這兩種效應明顯逆轉（圖2a）。這一結果表明，UA可以抑制HSCs的激活和肝細胞凋亡。在mRNA和蛋白水平上，CCl4組中肝纖維化相關因子（α-SMA、Collagen-1和TIMP-1）的表達在CCl4組（P<0.001）中增加，而抗纖維化因子MMP-1的表達減少（P<0.010）。UA治療后，抗纖維化因子MMP-1的表達增加（P<0.010）（圖2b-d）。這一結果表明，UA可以逆轉肝纖維化。

圖2 UA通過影響纖維化相關因子的表達來發揮抗纖維化作用

2. 熊果酸通過抑制NOX4和NLRP3炎癥信號減輕肝纖維化

免疫組化結果顯示，CCI4誘導的肝纖維化小鼠NOX4和NLRP3表達上調，UA治療后NOX4和NLRP3表達明顯（P<0.050）降低（圖3a）。PCR和Western blotting（P<0.050）顯示相似的結果（圖3c-e）。這一發現表明肝纖維化的發展與這兩個因子的表達有關。

圖3 熊果酸通過抑制NOX4和NLRP3信號通路減輕CCl4誘導的肝纖維化

3. 抑制NLRP3表達可有效緩解肝纖維化

HE染色，Masson染色和Sirius red 染色結果表明，與注射CCl4的WT小鼠相比，NLRP3^?/-組小鼠的膠原沉積明顯減輕（P<0.001）（圖4a-c）。此外，抑制NLRP3后，CCl4誘導的小鼠ALT（P<0.050）、AST（P<0.010）和羥脯氨酸（P<0.050）水平顯著降低（圖4d）。肝纖維化相關指標表達變化相似（圖4e-g），表明NLRP3是肝纖維化過程中重要的促纖維化因子。與NLRP3^?/-組相比，NLRP3^?/- UA組膠原沉積和纖維間隔形成變化不明顯。血清指標和肝纖維化相關因素的變化也不明顯（圖4a-g）。在NLRP3^?/- UA小鼠中，與CCl4組相比，NOX4的mRNA和蛋白表達均降低（P<0.050）（圖4h-j）。

圖4 UA對NLRP3 ^{- /-}小鼠NLRP3炎癥小體表達的影響

4. 抑制NOX4表達可有效緩解肝纖維化

與肝纖維化WT小鼠相比，NOX4^?/- CCl4和CCl4 AP組小鼠的膠原沉積較少（P<0.050）（圖5a-c）。同樣，谷丙轉氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和羥脯氨酸水平也低于WT小鼠（圖5d），表明抑制NOX4可顯著恢復肝功能。相關纖維化因子的表達也表明NOX4在肝纖維化的發生發展中起重要作用（圖5e-g）。這些結果表明，抑制NOX4可以改善肝纖維化，并且NOX4是一種重要的促肝纖維化因子。HE染色, Masson染色和Sirius red染色結果顯示，與NOX4^?/- CCl4組和CCl4 AP組比較，NOX4組膠原沉積和纖維間隔形成無明顯差異，但仍低于WT組（P<0.010）（圖5a-c）。同樣，UA治療后血清肝功能損害指標也有一定程度的恢復，促纖維化因子表達下調，抗纖維化因子表達上調（圖5d-g）。

圖5 UA對NOX4^?/-小鼠NLRP3表達的影響

5. NOX4有效刺激了NLRP3表達

NLRP3^?/- CCl4小鼠與WT CCl4小鼠相比，NOX4的mRNA和蛋白表達均無明顯降低（P>0.050）（圖4h-j）。所有NOX4^?/-小鼠的NLRP3的mRNA和蛋白水平均顯著低于WT CCl4組（P<0.010）（圖5h-j）。這表明，NOX4可能是NLRP3的上游信號。

6. 微生物豐度多樣性的比較

檢測了四組的α多樣性指標（Chao1指數、Shannon指數），以了解腸道微生物多樣性（圖6a，b）（P<0.050）。CCl4組的多樣性顯著低于對照組，而NOX4^?/-組和NLRP3^?/-組的多樣性顯著高于CCl4組。分析β多樣性進一步評估各組之間腸道結構的差異（圖6c，d）。PCoA圖和NMDS分析顯示，對照組、CCl4組、NOX4^?/-組和NLRP3^?/-組的腸道結構存在差異，微生物種類的豐度也不同（圖6e）。

圖6 四組CCl4致肝纖維化小鼠腸道微生物多樣性的變化

7. 微生物豐度組成的比較

在微生物豐度方面，門水平（圖7a-c）上，在CCl4組有益細菌Firmicuts的豐度低于對照組（P<0.001）。NOX4^?/-組和NLRP3^?/-組Firmicuts豐度顯著增加（P<0.001）。而有害細菌變形桿菌則表現出相反的趨勢（P<0.050）。在種水平上（圖7d-i），與對照組相比，CCl4組小鼠腸道微生物群中攜帶了更多的Akkermansia菌（P<0.001）和更少的有益乳桿菌（P<0.010）。與CCl4組相比，NOX4^?/-組和NLRP3^?/-組的變化趨勢完全相反。

圖7 四組CCl4致肝纖維化小鼠的微生物豐度

8. 腸道結構與環境因素的關系

有益菌乳酸菌和有害菌Akkermansia與肝功能指標（AST、ALT、羥脯氨酸）相關，有害菌Akkermansia與這三項指標呈正相關。這一結果表明，腸道中有害菌的豐度隨著肝功能損害的增加而增加。抑制NOX4/NLRP3炎癥體信號通路可以減少有害菌的數量，增加有益菌的數量。UA通過NOX4/NLRP3炎癥小體途徑改善腸道結構。