富含血小板的血漿聯(lián)合臭氧可防止軟骨破壞，改善手術(shù)誘導(dǎo)的兔骨關(guān)節(jié)炎模型的負(fù)重不對(duì)稱性

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是老年人最常見(jiàn)的退行性疾病，其治療仍不理想。本研究旨在評(píng)估富血小板血漿（PRP）和臭氧（O3）聯(lián)合治療膝關(guān)節(jié)OA的療效并探討其治療機(jī)制。

30只雄性家兔隨機(jī)分為5組（對(duì)照組、OA組、PRP組、O3組和PRP+O3組）。改良Hulth手術(shù)制備兔OA模型。關(guān)節(jié)大體觀察、組織病理學(xué)檢查和軟骨評(píng)分系統(tǒng)用于評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨破壞情況。qRT-PCR檢測(cè)關(guān)節(jié)液中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）mRNA的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)軟骨組織中Ⅱ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）的表達(dá)。通過(guò)同側(cè)負(fù)重（PIW）不對(duì)稱百分比觀察疼痛行為。

PRP患者血小板含量較全血增加6.2倍。在誘導(dǎo)OA組（OA、PRP、O3和PRP+O3組）中，與OA、PRP和O3組相比，PRP+O3顯著抑制手術(shù)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)大體改變、軟骨組織病理學(xué)損傷和Mankin評(píng)分的增加（P<0.05）。通過(guò)負(fù)重不對(duì)稱性觀察到的疼痛行為，在給予PRP+O3后3周和6周，PRP+O3組的疼痛行為發(fā)生逆轉(zhuǎn)（PIW不對(duì)稱性：-10.66%±1.172%）。此外，PRP、O3和PRP+O3治療后，手術(shù)誘導(dǎo)的BMP-2mrna表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。通過(guò)免疫組化分析，與OA、PRP和O3組相比，PRP+O3組顯著增加了軟骨II型膠原的表達(dá)，但降低了MMP-1（P<0.05）。

PRP聯(lián)合O3可通過(guò)恢復(fù)進(jìn)行性O(shè)A中細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝和分解代謝之間的穩(wěn)態(tài)，防止軟骨破壞，改善負(fù)重不對(duì)稱性。此外，PRP和O3的組合可能比單獨(dú)使用這兩種藥物取得更好的效果。

富血小板血漿（PRP）；臭氧（O3）；骨關(guān)節(jié)炎；軟骨

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是老年人的常見(jiàn)疾病，是一種退行性疾病，由于影響整個(gè)關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致功能紊亂。關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)環(huán)境平衡受損在OA進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。目前，阻止骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展的治療方法并不令人滿意。因此，有必要制定治療這種疾病的新策略。

富含血小板血漿（PRP）是從全血中分離出來(lái)的，已知它能產(chǎn)生高濃度的血小板和相關(guān)的信號(hào)分子，包括生長(zhǎng)因子、趨化因子和其他細(xì)胞因子。一些研究表明，PRP在膝關(guān)節(jié)OA治療中具有刺激軟骨修復(fù)和延遲關(guān)節(jié)置換術(shù)的潛力。PRP是廣泛實(shí)驗(yàn)和臨床研究的主題，因?yàn)樗淖罴呀o藥方法、離心方案以及與其他緊密藥物的組合尚未建立。關(guān)節(jié)內(nèi)臭氧（O3）溶解于滑液中，氧化抗氧化劑和多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生活性氧和脂質(zhì)氧化。O3具有直接和間接清除自由基的能力，可使細(xì)胞氧化還原平衡正?；虼似淇筄A進(jìn)展的能力已被研究。它通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）和調(diào)節(jié)炎癥產(chǎn)生關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用，炎癥通過(guò)細(xì)胞因子的作用破壞軟骨基質(zhì)。我們以前的研究表明，單獨(dú)使用O3可以改善軟骨修復(fù)和功能性關(guān)節(jié)恢復(fù)，并且與各種注射藥物聯(lián)合使用也有一定的療效。研究表明，PRP和O3的聯(lián)合作用可以改善氧化應(yīng)激，促進(jìn)恢復(fù)，減輕疼痛和功能紊亂，使其成為治療膝關(guān)節(jié)OA的合適選擇。然而，PRP聯(lián)合O3治療OA療效的病理學(xué)證據(jù)尚不清楚。

本研究旨在為PRP聯(lián)合O3在手術(shù)誘導(dǎo)的兔膝關(guān)節(jié)模型上的療效提供病理學(xué)、疼痛樣行為和細(xì)胞外基質(zhì)代謝方面的首次證據(jù)，為PRP聯(lián)合O3治療OA膝關(guān)節(jié)闡明理論基礎(chǔ)。

PRP和O3制備

根據(jù)Landesberg等人報(bào)告的雙離心方案，提取自體血液樣本以制備PRP。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)耳靜脈用戊巴比妥（30mg/kg）靜脈深麻醉家兔后；然后從中耳動(dòng)脈提取9ml全血樣本，并將其轉(zhuǎn)移到10ml含有1ml 3.8%檸檬酸鈉作為抗凝劑的真空采集器中。從每個(gè)血樣中抽取0.2mL等分試樣進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，并以200g離心10min。第一次離心后，在新離心管中以200g離心血漿和棕黃色涂層10min。隨后，去除離心管3/4上部的貧血小板血漿，并均勻搖晃剩余液體以獲得PRP。另抽取0.2mL PRP進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。用血液分析儀檢測(cè)全血和PRP中的血小板和白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

使用德國(guó)卡特OZOMED醫(yī)用O3治療儀（北京新科以仁科技發(fā)展有限公司，中國(guó)，北京）以20μg/mL的濃度生成O3。

本研究符合國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（NIH出版物第85-23號(hào)，1996年修訂版）和中國(guó)衛(wèi)生部《動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)（RECLA20-01）批準(zhǔn)。從北京方圓源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：SCXK2014-0012）獲得30只雄性新西蘭兔（平均體重：2.4kg）。所有兔子都被允許在有規(guī)律的晝夜循環(huán)的溫度控制環(huán)境下自由獲取食物和水。盡量限制使用動(dòng)物的數(shù)量，盡量減少痛苦。設(shè)定人性化終點(diǎn)；在實(shí)驗(yàn)期間，患有慢性或嚴(yán)重疼痛或痛苦的動(dòng)物將被人道地安樂(lè)死。

所有兔均存活至治療結(jié)束。根據(jù)撲克牌抽簽結(jié)果，將30只家兔隨機(jī)分為5組（每組6只）：對(duì)照組（未治療）、OA組（OA模型）、PRP組（OA誘導(dǎo)兔注射0.6mL PRP）、O3組（OA誘導(dǎo)兔注射40μg O3）和PRP+O3組（向OA誘導(dǎo)的兔子注射0.6mL PRP和40μg O3）。未控制混雜因素。本文使用的樣本量和劑量是根據(jù)先前的實(shí)驗(yàn)確定的，其中PRP或O3關(guān)節(jié)內(nèi)注射到OA兔子體內(nèi)。未設(shè)定包括和排除的標(biāo)準(zhǔn)，也未排除任何動(dòng)物和數(shù)據(jù)點(diǎn)。由于治療的性質(zhì)，只有治療師知道組分配，以確保提供正確的干預(yù)；評(píng)估員和研究人員對(duì)組分配一無(wú)所知。

根據(jù)先前的報(bào)道，通過(guò)改良的Hulth方法在實(shí)驗(yàn)兔的左膝手術(shù)誘導(dǎo)OA具體而言，改良Hulth法的關(guān)鍵步驟包括前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶橫斷以及半月板切除術(shù)。術(shù)后6周，將PRP、O3和PRP聯(lián)合O3注射到家兔左膝，每周注射一次，共6周。

在左側(cè)（同側(cè)）和右側(cè)（對(duì)側(cè)）后肢之間，靜態(tài)負(fù)重分布不對(duì)稱的發(fā)展被用作關(guān)節(jié)疼痛樣癥狀的指標(biāo)，表現(xiàn)為同側(cè)負(fù)重百分比（PIW）的下降，計(jì)算方法為同側(cè)后肢重量除以雙側(cè)后肢重量，再乘以100%。在術(shù)后0、6、9和12周，使用YLS-11A失能測(cè)試儀（中國(guó)北京Zsdc技術(shù)公司）評(píng)估靜態(tài)負(fù)重。在測(cè)試儀中，當(dāng)兔子習(xí)慣于相對(duì)靜止的姿勢(shì)時(shí)，通過(guò)傳感器記錄5次試驗(yàn)中每個(gè)后肢超過(guò)5秒的平均重量。在統(tǒng)計(jì)分析中使用每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每只兔子的平均PIW。

最后一次注射后一周，用1ml生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔3次，收集關(guān)節(jié)腔中的液體，通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT PCR）分析方法檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的相對(duì)表達(dá)。使用TRIzol試劑（美國(guó)加利福尼亞州Invitrogen）提取關(guān)節(jié)液中的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。BMP-2的相對(duì)表達(dá)由甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）表達(dá)水平確定，并使用2-??CT法。表1內(nèi)部參考中列出了底漆序列和產(chǎn)品長(zhǎng)度。

RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；BMP-2,骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；GAPDH，甘油醛3-磷酸脫氫酶。

最后一次注射后一周，用過(guò)量戊巴比妥（120mg/kg）處死兔子，解剖左膝關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本在4%多聚甲醛中保存7天，在10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣3個(gè)月，然后用乙醇溶液脫水。接下來(lái)，將樣品包埋在石蠟中并切割成切片，并根據(jù)Mankin評(píng)分系統(tǒng)用蘇木精和伊紅（H&E）或甲苯胺藍(lán)（TB）染色進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，包括軟骨表面損傷、結(jié)構(gòu)損傷、基質(zhì)染色缺失，潮標(biāo)完整性和病變部位比例的喪失。

評(píng)估II型膠原和MMP-1的免疫反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性被0.3%H2O2阻斷30分鐘，然后用PBS沖洗并用牛血清白蛋白V阻斷液阻斷30分鐘。切片在4℃下與抗II型膠原（1:200，Proteintech，CA，USA）或MMP-1（1:100，Proteintech，CA，USA）的抗體一起孵育過(guò)夜。用PBS沖洗后，切片用山羊抗兔IgG孵育，并用DAB顯色劑顯影。通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性染色的軟骨細(xì)胞數(shù)量來(lái)估計(jì)軟骨中抗原的存在。使用Image Pro Plus 5.1版軟件計(jì)算關(guān)節(jié)軟骨三個(gè)中心區(qū)域的總軟骨細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性染色軟骨細(xì)胞數(shù)。測(cè)定各組抗原染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

主要結(jié)果是軟骨改變和破壞的程度。次要結(jié)果是負(fù)重不對(duì)稱和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的改善。

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。使用SPSS 21.0（美國(guó)紐約國(guó)際商用機(jī)器公司）軟件和GraphPad Prism 8.0（美國(guó)加利福尼亞州GraphPad軟件公司）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)的正態(tài)分布通過(guò)D'Agostino和Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。如果數(shù)據(jù)不呈現(xiàn)正態(tài)分布，則使用非參數(shù)分析。

通過(guò)雙向方差分析（ANOVA）評(píng)估PIW不對(duì)稱性隨時(shí)間的差異，然后進(jìn)行Bonferroni后測(cè)，以比較兩個(gè)以上組之間的差異。多組間的其他數(shù)據(jù)評(píng)估采用單因素方差分析和Tukey后檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

PRP的評(píng)估

根據(jù)圖1A所示的關(guān)節(jié)內(nèi)策略，用PRP、O3或PRP+O3治療Hulth誘導(dǎo)的OA兔。在PRP和PRP+O3組的血液樣本中，全血和PRP中的血小板平均濃度分別為346.25±63.57×10E9/L和2151.75±439.25×10E9/L。PRP組血小板密度是外周血的6.2倍，差異有顯著性（P<0.05）。相比之下，PRP中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)于全血減少。對(duì)于全血，平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)為9.84±1.14×10E9/L，而對(duì)于PRP，平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.39±0.92×10E9/L。這些數(shù)據(jù)表明制備的PRP不富含白細(xì)胞。

圖1關(guān)節(jié)內(nèi)注射的設(shè)計(jì)和股骨關(guān)節(jié)面的大體外觀比較。（A） 左膝示意圖顯示了關(guān)節(jié)內(nèi)注射的方案。（B） 治療6周后關(guān)節(jié)面（股骨）骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的代表性大體圖像。紅色框表示OA檢查的區(qū)域。圖像的放大倍數(shù)為×2。所有組（n=6）。OA，骨性關(guān)節(jié)炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。

PRP聯(lián)合O3減輕OA兔關(guān)節(jié)大體改變

OA組的大體關(guān)節(jié)觀察顯示前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板缺失，OA發(fā)生顯著變化，包括軟骨侵蝕、骨贅形成、股骨周圍滑膜水腫和增厚（圖1B）。視覺(jué)觀察結(jié)果與OA特征一致（24），表明OA成功誘導(dǎo)。然而，在PRP、O3和PRP聯(lián)合O3處理的兔子中觀察到軟骨缺損和滑膜厚度顯著減少。

PRP聯(lián)合O3預(yù)防OA兔軟骨破壞

在OA組兔子中，與對(duì)照組兔子相比，H&E和TB染色顯示表面軟骨損傷顯著增加，軟骨細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞外基質(zhì)染色不均勻（圖2A、2B）。相比之下，與OA組相比，PRP、O3和PRP+O3組的治療導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的表面損失和軟骨細(xì)胞紊亂更少。同時(shí)，與PRP和O3組相比，PRP+O3組細(xì)胞外基質(zhì)染色清晰均勻。OA組的關(guān)節(jié)Mankin評(píng)分（圖2C）與對(duì)照組相比顯著增加（P<0.01）。盡管PRP或O3暴露均導(dǎo)致曼金評(píng)分穩(wěn)步下降（均P<0.05），但與單一藥劑相比，PRP+O3組合顯示出更高的保護(hù)作用（P<0.05）。

圖2關(guān)節(jié)面（股骨）軟骨的組織學(xué)圖像和分析。（A） 關(guān)節(jié)軟骨的H&E和（B）TB染色切片。標(biāo)尺：50μm。（C） 用Mankin評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估軟骨破壞情況。所有組（n=6）。與對(duì)照組相比，各組之間存在顯著差異，如**P<0.01；與OA比較，P<0.05，P<0.01；并與PRP+O3作了比較?P<0.05。H&E、蘇木精和曙紅；TB，甲苯胺藍(lán)；OA，骨性關(guān)節(jié)炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。

PRP聯(lián)合O3改善OA兔負(fù)重不對(duì)稱性

通過(guò)負(fù)重分析檢測(cè)改良Hulth手術(shù)后疼痛樣癥狀的進(jìn)展（表2）。在基線檢查時(shí)，所有實(shí)驗(yàn)兔的PIW接近50%。定量數(shù)據(jù)顯示，與基線相比，所有OA誘導(dǎo)的兔子（OA組、PRP組、O3組和PRP+O3組）在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后6、9、12周）的PIW均顯著降低（P<0.05）。術(shù)后6周，即首次治療前，OA誘導(dǎo)的兔子之間的PIW沒(méi)有顯著差異。術(shù)后9周，O3組和PRP+O3組的負(fù)重評(píng)分明顯優(yōu)于PRP組（P<0.05，P<0.01）。12周后，PRP+O3組的PIW優(yōu)于O3組（P<0.01，P<0.05）。PRP聯(lián)合O3對(duì)OA兔靜態(tài)負(fù)重不對(duì)稱性的減輕作用比單次治療更早、更明顯。

與基線檢查相比，各組間差異顯著，如*P<0.01；與術(shù)后6周比較，P<0.05，P<0.01。PIW，同側(cè)負(fù)重百分比；OA，骨性關(guān)節(jié)炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。

PRP聯(lián)合O3對(duì)OA兔細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的調(diào)控

BMP-2與細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝和骨贅形成密切相關(guān)。如圖3所示，骨關(guān)節(jié)炎組兔關(guān)節(jié)液中BMP-2的相對(duì)mRNA表達(dá)高于對(duì)照組兔（P<0.01）。與OA組相比，PRP、O3和PRP+O3組BMP-2mrna表達(dá)降低（P<0.01，P<0.01，P<0.01）。

圖3通過(guò)qRT PCR檢測(cè)關(guān)節(jié)液中BMP-2的mRNA表達(dá)水平。GAPDH被用作內(nèi)部控制。所有組（n=6）。與對(duì)照組相比，各組之間存在顯著差異，如**P<0.01；與OA相比，as###P<0.01。BMP-2，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；qRTPCR，定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；GAPDH，3-磷酸甘油醛脫氫酶；OA，骨性關(guān)節(jié)炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。

進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估OA兔軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝情況（圖4A、4B）。PRP和/或O3治療可在很大程度上逆轉(zhuǎn)手術(shù)誘導(dǎo)的軟骨中II型膠原的減少，而關(guān)節(jié)內(nèi)治療后關(guān)節(jié)炎模型中MMP-1表達(dá)的增加顯著下調(diào)。值得注意的是，PRP+O3的改善效果比單獨(dú)使用PRP或O3更明顯（P<0.05）。

圖4（A，B）股骨關(guān)節(jié)面切片中II型膠原和MMP-1的免疫組織化學(xué)分析。標(biāo)尺：50μm。所有組（n=6）。與對(duì)照組相比，各組之間存在顯著差異，如*P<0.05；與骨性關(guān)節(jié)炎比較#P<0.05；并與PRP+O3作了比較?P<0.05，??P<0.01。MMP-1，基質(zhì)金屬蛋白酶-1；OA，骨性關(guān)節(jié)炎；PRP，富血小板血漿；O3，臭氧。

我們的研究結(jié)果表明，PRP和O3聯(lián)合應(yīng)用對(duì)手術(shù)誘發(fā)OA的進(jìn)展具有良好的效果。結(jié)果顯示，在使用PRP+O3后，這種組合對(duì)關(guān)節(jié)損傷的預(yù)防有效果，并提高了同側(cè)后肢的靜態(tài)負(fù)重百分比。最后，我們發(fā)現(xiàn)PRP+O3可降低滑膜BMP-2 mRNA表達(dá)水平和軟骨II型膠原和MMP-1免疫標(biāo)記軟骨細(xì)胞的數(shù)量。這些發(fā)現(xiàn)提供了可靠的證據(jù)，表明PRP與O3聯(lián)合調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)，從而防止軟骨破壞和改善兔OA的負(fù)重不對(duì)稱性。值得注意的是，我們目前的研究包括對(duì)照組以及聯(lián)合治療后軟骨外觀的直接病理學(xué)證據(jù)。

骨性關(guān)節(jié)炎是一種使人衰弱的疾病，會(huì)降低老年人的生活質(zhì)量并導(dǎo)致永久性殘疾。在骨性關(guān)節(jié)炎的臨床情況下，一種簡(jiǎn)單的藥物不能同時(shí)解決癥狀和病理學(xué)問(wèn)題。因此，在OA管理中需要尋找具有互補(bǔ)機(jī)制的潛在多模式治療。PRP被認(rèn)為通過(guò)影響軟骨退行性進(jìn)展的整個(gè)關(guān)節(jié)環(huán)境來(lái)進(jìn)行短期臨床改善。臨床結(jié)果可能受到方法學(xué)變量的影響，需要對(duì)這些變量進(jìn)行研究，以優(yōu)化關(guān)節(jié)內(nèi)PRP治療OA進(jìn)展。最近，Dernek等人表明，與單獨(dú)的PRP治療相比，接受PRP治療聯(lián)合O3治療的患者能夠更早地緩解OA癥狀。然而，由于其回顧性和缺乏組織病理學(xué)檢查來(lái)證明關(guān)節(jié)軟骨的改善，本研究存在一些局限性。

越來(lái)越多的人認(rèn)識(shí)到，關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)環(huán)境平衡受損有助于OA的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展。事實(shí)上，許多細(xì)胞因子與關(guān)節(jié)成分降解相關(guān)，這超過(guò)了修復(fù)能力，導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解。BMP-2是TGF-β超家族中參與分化的關(guān)鍵因子之一，在軟骨形成的各個(gè)階段，包括II型膠原的合成和軟骨細(xì)胞合成代謝的調(diào)節(jié)，都顯示出重要的作用。盡管BMP-2具有強(qiáng)大的合成代謝作用，但它也可導(dǎo)致聚集蛋白聚糖的降解并促進(jìn)OA樣軟骨的丟失。根據(jù)骨性關(guān)節(jié)炎的程度，BMP-2水平在不同的骨性關(guān)節(jié)炎軟骨層和骨贅生物中升高。此外，刺激促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α可增加軟骨細(xì)胞中活性BMP-2的表達(dá)。研究表明，關(guān)節(jié)軟骨中慢性低度炎癥的存在有助于OA的發(fā)展。所有這些都表明BMP-2在OA的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。最近的研究表明，關(guān)節(jié)液BMP-2濃度與膝OA關(guān)節(jié)損傷的影像學(xué)和癥狀嚴(yán)重程度有顯著相關(guān)性。創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)中BMP-2水平的上調(diào)可通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)合成促進(jìn)組織修復(fù)，而另一方面通過(guò)刺激MMPs表達(dá)導(dǎo)致膠原更高水平的變性。據(jù)報(bào)道，MMP家族通過(guò)在軟骨基質(zhì)成分的降解調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在進(jìn)行性O(shè)A中起主要作用。MMP-1是一種限速II型膠原酶，引起細(xì)胞外基質(zhì)的降解和破壞，并激活其他MMP家族成員在OA中發(fā)揮重要作用。與先前的研究結(jié)果一致，Hulth誘導(dǎo)的OA兔關(guān)節(jié)液中BMP-2 mRNA表達(dá)升高，關(guān)節(jié)軟骨中MMP-1表達(dá)升高。此外，在我們的OA模型中，組織病理學(xué)改變包括軟骨基質(zhì)的破壞和鈣化。簡(jiǎn)言之，這些發(fā)現(xiàn)表明，在OA進(jìn)展過(guò)程中，BMP-2 mRNA的滑膜表達(dá)與細(xì)胞外基質(zhì)的降解密切相關(guān)。

一些研究證實(shí)，PRP濃縮了多種血小板、生長(zhǎng)因子和生物活性成分，為細(xì)胞增殖和基質(zhì)積累提供了合適的微環(huán)境。在我們的研究中，闡明了PRP與O3聯(lián)合抑制的時(shí)間及其效果。作為軟骨修復(fù)的直接和間接氧化劑，O3可在關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生活性氧產(chǎn)物和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物。最近的研究表明，氧化脂質(zhì)可刺激血小板活化，確保在纖維蛋白收縮和纖維蛋白溶解期間觸發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可能通過(guò)將PRP限制在關(guān)節(jié)腔來(lái)提高療效。我們假設(shè)PRP與O3結(jié)合可能協(xié)調(diào)信號(hào)元件的釋放，使PRP更好地粘附于軟骨表面和滑膜，并抑制降解膝OA細(xì)胞外基質(zhì)的MMP的釋放。這可能解釋了PRP聯(lián)合O3具有更好的治療效果。

在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中，疼痛是突出的癥狀，是臨床決策的主要驅(qū)動(dòng)力。負(fù)重分析的分布對(duì)于評(píng)估OA引起的疼痛非常重要，膝關(guān)節(jié)OA患者常出現(xiàn)同側(cè)下肢無(wú)力。我們先前的研究表明關(guān)節(jié)內(nèi)O3注射改善了OA兔的靜態(tài)負(fù)重不對(duì)稱性。類似地，Gowler等人使用負(fù)重不對(duì)稱性來(lái)評(píng)估手術(shù)誘導(dǎo)的動(dòng)物OA模型的鎮(zhèn)痛效果。在本研究中，PRP和O3的聯(lián)合使用協(xié)同促進(jìn)了軟骨保護(hù)和分解代謝的減少，從而最終增強(qiáng)了同側(cè)負(fù)重恢復(fù)，這與先前的研究一致，這些研究表明關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)有助于OA鎮(zhèn)痛作用。

Hulth誘導(dǎo)的模型導(dǎo)致關(guān)節(jié)不穩(wěn)定，產(chǎn)生創(chuàng)傷性O(shè)A，并可靠地模擬人類OA的發(fā)病機(jī)制和病理改變。在這項(xiàng)研究中，主要的限制是沒(méi)有使用不同劑量的對(duì)照組，主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限。盡管需要進(jìn)行更多研究，以確定最佳PRP制備方案和劑量方案，這些結(jié)果證實(shí)了PRP和O3聯(lián)合使用能夠逆轉(zhuǎn)與OA相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝，從而建立保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨和改善OA進(jìn)展引起的負(fù)重行為改變的治療能力。

在這項(xiàng)動(dòng)物研究中，我們?cè)u(píng)估了關(guān)節(jié)內(nèi)注射PRP和O3聯(lián)合治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種有前途的策略，并且可能優(yōu)于單獨(dú)注射PRP或O3。此外，PRP聯(lián)合O3的保護(hù)作用可能參與了細(xì)胞外基質(zhì)的代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。