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介紹 結(jié)直腸癌(CRC)是世界范圍致死率較高的癌癥類型之一，免疫治療在治療結(jié)直腸癌方面發(fā)揮著越來越重要的作用。免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以促進(jìn)T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞，延長(zhǎng)患者生存期。同時(shí)，由于結(jié)直腸癌免疫反應(yīng)的異質(zhì)性，其免疫治療仍具有巨大挑戰(zhàn)性。腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)與腫瘤免疫應(yīng)答相關(guān)，可用于預(yù)測(cè)患者的免疫治療反應(yīng)和生存期，其中CD8+TIL可以殺死腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為影響結(jié)直腸癌的預(yù)后、免疫治療反應(yīng)和生存結(jié)果的重要因素。 DNA甲基化是組織特異性的，在組織分化中起著決定性的作用。因此，DNA甲基化在不同組織和器官的細(xì)胞中是不同的，它有可能成為識(shí)別不同細(xì)胞的標(biāo)志物。其中，中等CpG密度區(qū)的甲基化是高度保守的，可以區(qū)分不同來源的組織類型。此外，在淋巴細(xì)胞激活和增殖過程中，部分甲基化區(qū)域(PMD)會(huì)發(fā)生低甲基化，在這些區(qū)域中CpG的甲基化可能會(huì)將免疫細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞區(qū)分開來，這可以通過solo-WCGW來預(yù)測(cè)。對(duì)此，作者開發(fā)了一種新的檢測(cè)方法，通過利用這些低CpG密度的甲基化來開發(fā)生物標(biāo)記物。 在這項(xiàng)研究中，作者的目的是分析免疫細(xì)胞和結(jié)腸上皮細(xì)胞的全基因組DNA甲基化圖譜，以確定CD8+T細(xì)胞特異的差異甲基化位置(DMP)。然后，作者通過使用這些DMP構(gòu)建CD8+MeTIL評(píng)估系統(tǒng)來分析CD8+TIL和結(jié)直腸癌以及其他癌癥生存結(jié)果的關(guān)系。最后，作者開發(fā)了一種基于qPCR的檢測(cè)方法，樣本來自于福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織，提取其中少量DNA即可進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)直腸腫瘤中CD8+TIL的DNA甲基化特征 這項(xiàng)研究的整體思路和人群隊(duì)列設(shè)計(jì)如圖1所示。為了發(fā)現(xiàn)CD8+MeTIL特征，作者首先利用EPIC芯片（即850K芯片）分析基因組甲基化數(shù)據(jù)，將CD8+T細(xì)胞的甲基化特征與腫瘤和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞以及其他人源免疫細(xì)胞(包括CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)的甲基化特征進(jìn)行了比較，作者鑒定出了73個(gè)CD8+T細(xì)胞特異性的DMP。
圖1 在分析這些特異性DMP生物學(xué)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)CpG位于基因內(nèi)區(qū)域(80.6%)，包括CD8A、CD8B、CD96等CD8+T細(xì)胞功能基因，少數(shù)為基因間CpG(19.2%)。作者進(jìn)行了GO分析，發(fā)現(xiàn)大多基因富集在免疫相關(guān)功能上(圖2C)。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了已鑒定的CpG與CD8+T細(xì)胞有一定的相關(guān)性。 接下來，作者對(duì)這73個(gè)CpG的基因組特征進(jìn)行了分析。大多數(shù)位于低CpG密度區(qū)(60.3%，44個(gè)探針)和中等CpG密度區(qū)(34.2%，25個(gè)探針)，少數(shù)(5.5%，4個(gè)探針)位于高CpG密度區(qū)(CpG島)(圖2B)。根據(jù)已有的基因組注釋，其中6個(gè)CpGS是Sole-WCGW CpGS，10個(gè)CpGS位于共同的PMD中。 作者應(yīng)用最小絕對(duì)收縮和選擇算子(LASSO)機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，從73個(gè)CD8+T細(xì)胞特異性CpG中選擇出了最具代表性的CpG，命名為CD8+MeTIL score，包括位于CpG低密度區(qū)的三個(gè)CpG(cg02430840、cg06113913和cg12673499)。將CD8+MeTIL值與β值及相關(guān)系數(shù)進(jìn)行套索回歸分析，得出CD8+MeTIL值為： cg02430840×0.28724+cg06113913×0.40171+cg12673499×0.45016 為了測(cè)試CD8+MeTIL評(píng)估系統(tǒng)的性能，作者使用三個(gè)CpG對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析。通過評(píng)估這三種CpG，CD8+T細(xì)胞可以很好地與其他細(xì)胞類型區(qū)分開來(圖2D)。具體的分類結(jié)果如圖2E所示。接下來，作者試圖用EPIC芯片數(shù)據(jù)調(diào)查45例SAH-SYSU結(jié)直腸癌病例中CD8+MeTIL評(píng)分中所選的三個(gè)CpG的甲基化特征與臨床病理特征之間的關(guān)系(圖2F)。作者發(fā)現(xiàn)，CD8+MeTIL評(píng)分較低且甲基化較少的三種CpGS與低頻率微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI-H)、高分化的結(jié)直腸癌相關(guān),這些結(jié)果與之前基于IHC的CD8+TIL相關(guān)性研究結(jié)果一致。
圖2 基于qPCR的CD8+MeTIL單堿基分辨率分析 作者建立了一種基于qPCR的分析方法(QASM)，以單堿基分辨率檢測(cè)位于低CpG密度區(qū)域選定的三個(gè)CpG的甲基化。如圖3A所示，每個(gè)CpG的甲基化和非甲基化等位基因可以通過探針被量化，其中甲基化百分比可以由兩個(gè)探針的信號(hào)比來表示。 為了驗(yàn)證這種基于qPCR的方法確定CD8+MeTIL評(píng)分的有效性，作者接下來將QASM分析的結(jié)果與SAH-SYSU隊(duì)列中的EPIC芯片和焦磷酸測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行了比較。基于qPCR的甲基化百分率和基于EPIC芯片的甲基化百分率在每個(gè)CpG中呈線性相關(guān)(圖3B；n=45，r=0.5225-0.7274，p<0.001)。此外，QASM法測(cè)定的甲基化百分率與焦磷酸測(cè)序測(cè)定的甲基化百分率呈線性相關(guān)(圖3C；n=12，r=0.7170-0.9411，P<0.01)。QASM分析產(chǎn)生的CD8+MeTIL分?jǐn)?shù)與EPIC芯片和焦磷酸測(cè)序產(chǎn)生的分?jǐn)?shù)呈線性相關(guān)(圖3；n=45和12，r分別為0.7357和0.9025；P<0.001)。因此，QASM法是測(cè)定CD8+MeTIL評(píng)分的一種可靠的技術(shù)方法。 為了用CD8+MeTIL評(píng)分測(cè)定CD8+TIL的分布，作者首先用QASM方法檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織(n=45)及其周圍正常組織(n=44)、正常(NCM460)和癌變(RKO、SW48、HCT8和HCT15)結(jié)腸上皮細(xì)胞以及代表結(jié)直腸癌組織主要成分的多種免疫細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞)中3種CpG的甲基化百分率。與其他細(xì)胞相比，CD8+T細(xì)胞的CD8+MeTIL評(píng)分明顯降低(圖4A)，并與EPIC芯片數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致，進(jìn)一步支持了基于qPCR的CD8+MeTIL評(píng)分準(zhǔn)確性，可以用這種方法確定腫瘤樣本中CD8+T細(xì)胞的豐度。
圖3 用CD8+MeTIL方法評(píng)估CD8+TIL在結(jié)直腸癌中的分布 作者應(yīng)用這種基于qPCR的CD8+MeTIL方法來評(píng)估腫瘤組織中的CD8+TIL，并將其與SAH-SYSU隊(duì)列中IHC染色測(cè)定的CD8+TIL(CD8+PaTIL)進(jìn)行比較(圖4B、C)。CD8+PaTIL與CD8+MeTIL呈顯著負(fù)相關(guān)(r=?0.6385，p=0.011)。 作者進(jìn)一步比較了CD8+MeTIL評(píng)分和基于CD8+表達(dá)的TIL(CD8+ExTIL)，CD8+ExTIL是CD8B基因表達(dá)的分子特征，用于評(píng)估CD8+MeTIL。作者檢測(cè)了編碼部分CD8抗原的CD8B基因在SAH-SYSU隊(duì)列中的mRNA表達(dá)。CD8+MeTIL評(píng)分與CD8B基因表達(dá)特征呈顯著負(fù)相關(guān)(r=?0.4079，p=0.008；圖4D)?？傊?，QASM法測(cè)定的CD8+MeTIL評(píng)分較低與結(jié)直腸癌組織中CD8+T細(xì)胞平均密度(CD8+PaTIL)和CD8B基因(CD8+ExTIL)表達(dá)增加相關(guān)。 接下來，作者根據(jù)CCFR隊(duì)列中結(jié)直腸癌患者的分子特征，對(duì)QASM法測(cè)定的CD8+MeTIL評(píng)分的分布進(jìn)行評(píng)估。MSI-H組CD8+MeTIL評(píng)分明顯低于低頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定/穩(wěn)定組(77.8vs82.1，p<0.001)；此外，CIMP陽性腫瘤(78.5vs81.6，p=0.048)和右半結(jié)腸腫瘤(78.9vs82.1，p<0.001)的CD8+TIL評(píng)分明顯低于CIMP陰性腫瘤和左半結(jié)腸腫瘤(圖4E)。
圖4 CD8+MeTIL在結(jié)直腸癌和多發(fā)性腫瘤預(yù)后中的價(jià)值 考慮到CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用，作者試圖測(cè)試CD8+MeTIL評(píng)分在預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌預(yù)后中的作用。作者用QASM法測(cè)定SAH-SYSU(n=237)和CCFR(n=335)隊(duì)列中的癌細(xì)胞CD8+MeTIL評(píng)分。在SAH-SYSU(圖5A；HR=0.303，95% CI 0.109~0.842，p=0.022)和CCFR(圖5C；HR=3.17，95% CI1.26~7.99，p=0.009)隊(duì)列中，CD8+MeTIL評(píng)分低的患者OS明顯好于CD8+MeTIL評(píng)分高的患者。在多變量Cox分析中，調(diào)整了年齡、TNM分期、KRAS突變和淋巴血管侵犯等其他顯著危險(xiǎn)因素后，進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。 接下來，作者探討CD8+MeTIL評(píng)分是否可以在標(biāo)記物預(yù)測(cè)分析中進(jìn)一步對(duì)MSI-H/MSI-L/MSS患者進(jìn)行分類。在生存分析中，根據(jù)SAH-SYSU和CCFR隊(duì)列中的MS狀態(tài)和CD8+MeTIL評(píng)分對(duì)患者進(jìn)行分組。與預(yù)期一致，死亡風(fēng)險(xiǎn)可以通過CD8+MeTIL評(píng)分在每個(gè)微衛(wèi)星亞組中進(jìn)一步分層(圖5B、D)。值得注意的是，MSI-H和CD8+TIL豐富(CD8+MeTIL評(píng)分低)的患者在兩個(gè)隊(duì)列中都有最好的OS，而MSI-L/MSS和CD8+TIL水平低(CD8+MeTIL評(píng)分高)在兩個(gè)隊(duì)列中都預(yù)示著OS較差。雖然這一評(píng)分是在結(jié)直腸癌中制定的，但作者利用EPIC甲基化芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CD8+MeTIL評(píng)分也與非小細(xì)胞肺癌的抗PD-1治療反應(yīng)和生存質(zhì)量顯著相關(guān)。 由于CD8+MeTIL標(biāo)記是使用EPIC甲基化芯片數(shù)據(jù)在結(jié)直腸癌中開發(fā)出來的，作者使用TCGA中提供的450K甲基化芯片數(shù)據(jù)對(duì)其他癌癥類型進(jìn)行了生存分析。在24種癌癥類型中的6種癌癥(肺腺癌(p=0.033)，肺鱗癌(p=0.038)，結(jié)直腸癌(p=0.048)，宮頸鱗癌(p=0.044)，乳腺浸潤(rùn)性癌(p=0.011)，腎上腺皮質(zhì)癌(p=0.033))中，低CD8+MeTIL評(píng)分與較好的生存結(jié)果顯著相關(guān)(圖5F)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明CD8+MeTIL評(píng)分可以預(yù)測(cè)多種癌癥的生存結(jié)果。
圖5 結(jié)論 腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)，尤其是CD8+TIL可用于預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)和預(yù)后。然而，目前對(duì)CD8+TIL的評(píng)估依賴于高度特異性的組織病理學(xué)方法。因此，在這項(xiàng)研究中，作者開發(fā)了一種基于DNA甲基化的CD8+MeTIL標(biāo)記。通過使用從Illumina EPIC甲基化芯片中鑒定的CD8+T細(xì)胞特異性差異甲基化位點(diǎn)(DMP)構(gòu)建CD8+MeTIL評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。采用免疫細(xì)胞、結(jié)腸上皮細(xì)胞和兩個(gè)結(jié)直腸癌隊(duì)列(n=282和335)，建立了一種基于PCR的DNA甲基化定量分析方法，在單堿基分辨(QASM)下檢測(cè)不同的CD8+MeTIL信號(hào)。 作者建立的CD8+MeTIL標(biāo)記的QASM檢測(cè)方法可以完全定量、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地檢測(cè)CD8+TIL的分布。QASM法測(cè)定的CD8+MeTIL與以組織病理學(xué)為基礎(chǔ)的CD8+TIL和以基因表達(dá)為基礎(chǔ)的免疫標(biāo)記物有很強(qiáng)的相關(guān)性。此外，作者還進(jìn)一步驗(yàn)證了這種方法在兩個(gè)結(jié)直腸癌隊(duì)列和與其他癌癥的TCGA隊(duì)列中對(duì)MSI/MSS狀態(tài)和預(yù)后結(jié)果進(jìn)行分層的能力，結(jié)果表明，低CD8+MeTIL評(píng)分(豐富的CD8+TIL)與MSI-H腫瘤相關(guān)，并預(yù)測(cè)這類患者會(huì)有更好的生存期。未來，CD8+MeTIL標(biāo)記有可能成為一個(gè)具有重要臨床診斷意義的生物標(biāo)志物，能夠?yàn)榘庖咧委熢趦?nèi)的多種治療方法的選擇提供幫助。 這里是專注表觀組學(xué)研究的易基因，歡迎關(guān)注～ |
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