黃酮類化合物作為人中性粒細胞彈性蛋白酶的抑制劑

彈性蛋白酶是一種蛋白水解酶，屬于由人類嗜中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞產生的水解酶家族。已知人中性粒細胞彈性蛋白酶在人體中發揮多種作用，但其活性增加可能會導致多種疾病。彈性蛋白酶抑制劑可以預防銀屑病、慢性腎病、呼吸系統疾病（包括 COVID-19）、免疫疾病甚至癌癥的發展。在多酚類化合物中，一些黃酮類化合物及其衍生物（主要存在于草本植物中）已被證實會影響彈性蛋白酶的釋放及其對人體細胞的作用。這篇綜述著重于從天然來源中發現并在生物化學上被表征為類黃酮的彈性蛋白酶抑制劑。對彈性蛋白酶的抑制活性是黃酮苷元及其糖苷和甲基化、乙酰化和羥基化衍生物的特征。所提出的結構-活性關系 (SAR) 分析能夠確定對彈性蛋白酶產生抑制作用的化學基團。進一步研究，尤其是所描述的天然化合物的體內功效和安全性是有意義的，以便更好地了解它們促進健康的潛力。

抑制人類酶活性是治療全球疾病的一種有趣策略，并且可能是追求新藥發現的有吸引力的目標1。通過彈性蛋白酶抑制劑調節酶活性是治療類風濕性關節炎、腎小球腎炎、肺氣腫、肺部疾病、銀屑病和癌癥2、3的有希望的努力。

中性粒細胞對先天免疫反應至關重要；因此，他們參與抗擊感染。中性粒細胞活化和脫粒導致絲氨酸蛋白酶（彈性蛋白酶、蛋白酶 3、組織蛋白酶 G）作為蛋白水解活性酶釋放到細胞外空間，能夠降解廣譜的細胞外基質 (ECM) 蛋白，例如纖連蛋白、彈性蛋白、或膠原蛋白，為組織提供物理支持和穩定性4-7。中性粒細胞衍生的蛋白酶，包括彈性蛋白酶，具有通過產生免疫反應來控制炎性細胞因子作用的能力。然而，人類中性粒細胞彈性蛋白酶 (HNE) 也能夠加劇其他疾病的出現8-10.HNE 屬于絲氨酸蛋白酶的糜蛋白酶超家族，參與細胞內和細胞外病原體破壞的非氧化途徑。彈性蛋白酶由人類中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞產生，主要儲存在嗜天青顆粒和核膜11、12中。在生理條件下，HNE 會被天然絲氨酸蛋白酶抑制劑（包括 elafin、α1-抗胰蛋白酶和分泌性白細胞蛋白酶抑制劑 (SLIP)5 ）抵消.然而，內源性抑制劑的保護作用可以通過中性粒細胞與其他白細胞產生的 ECM、氧化劑和蛋白酶的粘附以及通過將 HNE 與細胞膜上的受體強烈連接而失活，從而抑制與可接近的內源性抑制劑的結合13。總體而言，HNE 及其抑制劑數量的波動在誘發多種人類疾病中起關鍵作用。

盡管可以使用合成抑制劑，但天然衍生藥物的鑒定對于鑒定沒有令人不快的副作用的抑制劑來說是一個有價值的研究領域。在多酚類化合物中，一些主要存在于草本植物中的黃酮類化合物及其衍生物是彈性蛋白酶的潛在抑制劑，幾乎沒有副作用。本綜述側重于黃酮類化合物及其衍生物在彈性蛋白酶抑制劑開發中的多種作用和功效。

搜索策略有助于澄清適當的搜索字符串并找到相關的主題數據庫以準確識別適當的科學研究。這篇綜述的搜索數據庫是 Taylor & Francis Online、Google Scholar、EBSCO Discovery Service (EDS)、REAXYS Database、SCOPUS、PubMed/MEDLINE、Web of Science (SCI-EXPANDED)、Wiley Online Library 和 Science Direct/ELSEVIER。對于審查方法，使用以下關鍵字的不同組合搜索上述數據庫：彈性蛋白酶、中性粒細胞、生物功能、彈性蛋白酶活性、絲氨酸蛋白酶、感染、抑制劑、黃酮類化合物、人類疾病、酶、生物活性和免疫反應。

在成年哺乳動物中，中性粒細胞在骨髓中產生，并在某些生理條件下釋放到血液和組織中。人體每天每公斤體重產生超過 10 億個中性粒細胞。然而，在各種自身免疫和炎癥性疾病期間，它們的數量可以擴大到 100 億。在炎癥環境中，中性粒細胞可以存活 7 天，這可能與細胞因子激活的內皮細胞作用有關14.它們是抵御細菌和真菌感染的第一道防線，有助于對抗寄生蟲和病毒。它們的多種功能包括防止活性氧 (ROS) 和水解酶以及消除病原體，從而使它們成為整體免疫和炎癥反應（吞噬作用、脫粒和 NETosis）的重要組成部分。另一方面，這種類型的白細胞能夠在各種自身免疫性疾病和炎癥性疾病中造成組織損傷，并在各種病理15中發揮重要作用。

中性粒細胞的功能之一是產生和釋放絲氨酸蛋白酶（彈性蛋白酶、蛋白酶 3 和組織蛋白酶 G）。眾所周知，HNE 在人體中發揮多種作用。彈性蛋白酶是一種具有細胞毒性的 29 kDa 蛋白酶，序列分析表明它由具有單鏈和 218 個氨基酸的多肽組成，其中四個分子內二硫鍵連接八個半胱氨酸殘基16、17。

釋放酶以通過其控制細胞凋亡的能力來防御入侵的病原體18,19。中性粒細胞彈性蛋白酶 (NE) 的作用機制是基于裂解細菌毒力因子及其外膜蛋白并與細菌膜10結合。此外，HNE 通過 Toll 樣受體 4 (TLR4) 激活和其他促炎細胞因子的釋放誘導白細胞介素 8 (IL-8) 參與炎癥反應20-22。這種酶還可能導致彈性纖維的降解并誘導角質形成細胞23、24的增殖。HNE的其他生物學功能見表1。

先天免疫反應的主要目標是定位和消滅進入人體的病原體。到達感染部位的第一個免疫系統成分之一是中性粒細胞。它們在 ROS 和參與氧化和非氧化防御途徑的酶的幫助下，通過非特異性免疫機制對抗病原體。HNE是具有抗菌活性的先天免疫系統中的關鍵因素之一。中性粒細胞彈性蛋白酶可以被組織蛋白酶 C 激活，然后該酶參與許多非氧化性免疫反應34。

吞噬作用是針對病原體的防御機制。它是通過細胞膜受體結合和識別病原體而引發的細胞內過程，這些受體隨后被吸收到稱為吞噬體的結構中35。之后，顆粒附著在被吸收的吞噬體上并脫落其內容物，由此產生的吞噬溶酶體開始降解被吸收的病原體。NE 通過降解外膜蛋白 A (OmpA) 殺死微生物，例如大腸桿菌，這會破壞細胞膜的完整性并導致隨后的死亡36。此外，絲氨酸蛋白酶的同時作用導致革蘭氏陽性肺炎鏈球菌在體內吞噬過程中死亡37.

另一種對抗需要彈性蛋白酶的微生物的方法是通過脫粒。與吞噬作用不同，該過程在 ECM 中顯示出活性。細胞因子對嗜中性粒細胞的刺激導致顆粒轉移到細胞外圍，其中顆粒與細胞膜融合，它們的內容物被倒出細胞11。初級顆粒含量針對病原體殺滅過程。然而，由于它們的高毒性，它們被釋放，同時對周圍組織38、39造成損害的可能性很高。細胞外 HNE 對許多細菌蛋白（例如白細胞毒素）顯示出切割作用，這是導致白細胞裂解的一個因素40、41。

此外，HNE 展示了其在 NETosis 中的活性，NETosis 是中性粒細胞用來對付病原體的一種機制。NETosis 是去濃縮和未折疊 DNA 與組蛋白和細胞質顆粒蛋白42的復合物。IL-8 和脂多糖 (LPS) 的誘導導致含有蛋白水解酶的中性粒細胞活化。因此，在這個過程中，NET 參與對抗感染，因為 NE 是影響 DNA 從濃縮形式釋放的因素之一。彈性蛋白酶被轉運到細胞核，其酶活性是組蛋白降解的決定因素，從而促進 DNA 的釋放43。此外，NETs 中的彈性蛋白酶對酵母菌、菌絲形式的真菌（例如白色念珠菌）是一種破壞性因素和細菌，例如福氏志賀氏菌42、44（圖1）。

圖 1.中性粒細胞的作用機制。(A) 脫粒；(B) 吞噬作用；(C) NETosis。

中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑在人類疾病中的作用

HNE 活性的持續增加可能導致與感染和炎癥相關的組織破壞。因此，HNE 功能涉及多種嚴重的慢性疾病，特別是呼吸、泌尿、皮膚、消化、生殖、神經和骨骼疾病（表 2）。

例如，alvelestat (MPH-966) 是一種口服 NE 抑制劑，通過控制異常炎癥反應、腸道屏障功能障礙和腸道微生物群失衡，對 5-FU 誘導的結直腸癌患者腸道粘膜炎具有不良影響58。值得一提的是，另一種 HNE 抑制劑 sivelestat (ONO-5046) 可能是一種有效的藥物，可用于治療 COVID-19 17、59患者的急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征或凝血障礙。此外，可以考慮這種選擇性 NE 抑制劑在抑制心肌梗塞后過度炎癥和細胞凋亡以及防止小鼠模型中左心室重構方面的作用60.ONO-5046 還限制了大鼠和小鼠模型中膠原蛋白誘導的關節炎的發生率61并預防了博來霉素誘導的小鼠肺纖維化62。據報道，在臨床試驗中使用其他彈性蛋白酶抑制劑后，如 ZD-0892 和 M249314（肽基三氟甲基酮），肺動脈壓力和肌化降低63。

此外，彈性蛋白酶能夠破壞 ECM 屏障的完整性，從而直接導致癌癥擴張7。

酚類化合物占多種植物次生代謝產物的很大比例。因此，黃酮苷元和苷類仍然是植物界中最廣泛的多酚類之一。黃酮類化合物由兩個苯環和一個雜環吡喃環組成，根據 B 碳環與 C 碳環的連接點及其氧化程度以及它們的化學取代度，可分為亞組64，65.由于 NE 在愈合過程和類風濕性關節炎、腎小球腎炎、肺氣腫、肺部疾病、銀屑病甚至癌癥的發展中的重要作用，一些研究報告了從天然來源中鑒定出彈性蛋白酶抑制劑。產生次生代謝物和植物化學物質的植物具有作為治療劑的巨大潛力2,3,66。已經研究了許多植物提取物和化合物的彈性蛋白酶抑制活性，以確定抗彈性蛋白酶藥物的新來源。研究了多種類黃酮化合物，包括苷元及其O-和C-糖苷的潛在彈性蛋白酶抑制活性（表 3）。

有報道楊梅素、米西汀、槲皮素、異鼠李素、山柰素、山柰酚的3 -O-β-d-葡萄糖苷酸，山柰酚的3-O-β-2″-O-乙酰基-β-d-葡萄糖苷酸、異鼠李素和槲皮素和山柰酚的 3 -O-β-3″-O-乙酰基-β-d-葡糖苷酸在 1 μM 濃度下顯著降低中性粒細胞釋放彈性蛋白酶101。在另一項化學和生物學研究中， Hedysarum coronarium地上部分的提取物具有高濃度槲皮素和單寧的 L. 顯示出劑量依賴性抑制特性102。

燈盞花素是一種從燈盞花燈盞花中提取的類黃酮，可降低接受心臟直視手術的兒童的肺部炎癥反應和肺功能相關的 NE 水平。在服用 1 mg/kg 或 0.5 mg/kg 燈盞花素103的患者中觀察到了積極作用。還選擇了從Scorzonera latifolia的乙酸乙酯提取物中分離的化合物，以進一步研究它們的抑制作用。槲皮素 3 -O-β-apiofuranosyl-(1?→2″)-β-d-葡萄糖苷和 7-甲基異葒草素分別顯示 30.16% 和 28.60% 的抗彈性蛋白酶活性104。從Malus doumeri獲得的根皮素變種。formosana已被證明以濃度依賴性方式抑制彈性蛋白酶。在 36.5–366 μM 的濃度下，觀察到 51.8–77.3% 的酶抑制105,106。濃度為 100 μM 的黃酮素櫻花素可將彈性蛋白酶的釋放減少 60%107。在另一項研究中，櫻花素被應用于體內小鼠模型，在預防彈性蛋白酶誘導的肺氣腫方面沒有顯示出不良的臨床效果108。在 100 μM 時，從粘花旋花中分離出的 7-O-甲基香樹脂可使彈性蛋白酶產量降低 50%107.還評估了甘草素的 NE 釋放抑制特性，結果顯示 10 μM 的化合物降低了酶活性109。5 -O-demethylnobiletin是一種從黃芪中分離出的多甲氧基黃酮，在 10 μM 時可抑制 48% 的彈性蛋白酶釋放。值得一提的是，所描述的類黃酮不影響這種酶110的活性。彈性蛋白酶檢測結果表明，在 100 μM 濃度下，柚皮素、甘草素、槲皮素、芹菜素和硫黃素分別具有 39%、52%、65%、57% 和 38% 的抑制活性111。從 EtOAc (乙酸乙酯) 子提取物中分離的化合物的彈性蛋白酶抑制活性還評估了Epilobium angustifolium 。金絲桃苷、山柰酚、山柰酚 3 -O-α-l-鼠李糖苷、槲皮素 3 -O-α-l-鼠李糖苷和槲皮素 3 -O-α-l-阿拉伯糖苷在 100 μg/mL 的濃度下顯示出 19.87 的抑制潛力%、15.33%、9.76%、8.92% 和 7.08%，分別為112。

從厚葉天竺葵葉中獲得的水乙醇提取物的抑制作用，總黃酮含量為 72.71 μg QE/mg DE，從 0.8 μg/mL（15.79% 彈性蛋白酶抑制）開始，在 4 μg/mL（41.44 %)、8 μg/mL (55.45%) 和 16 μg/mL (50.99%)113。女貞子葉水提物的抗彈性蛋白酶活性是根據黃酮苷元和苷（木犀草素苷、槲皮素蕓香苷和女貞子黃酮）的含量測定的。濃度范圍為 5 μg/mL 至 50 μg/mL 的水提取物抑制 HNE 釋放 23.9–34.1%114。值得一提的是，一種刺槐的乙醇提取物葉的總黃酮含量為 206.3 毫克/克，在體外10 毫克/毫升時表現出 99.2% 的抑制115。發酵紅參 (FRG) 基于其彈性蛋白酶抑制效力被研究為一種新型護膚抗衰老成分。FRG 由 133.2 μg/mL 類黃酮化合物組成，可能與彈性蛋白酶抑制活性的 IC50值 (117.07 μg/mL)相關116。對痢疾尤金尼葉水醇提取物 (EDE)進行了表征，以確定其槲皮素和其他酚類物質的含量，EDE 在 25–100 μg/mL 時能夠以劑量依賴性方式抑制彈性蛋白酶，在一定濃度下觀察到 45% 的活性100 μg/mL117。

許多作者已經根據 EC50值確定了抗彈性蛋白酶活性。Meum athamanticum、Centella asiatica和Aegopodium podagraria水-甘油提取物由大量的類黃酮化合物描述，并顯示抑制活性的EC50 (%) 值分別為 0.92、0.52 和 1.03118。

通過亞臨界水萃取從黑果花的莖、葉和漿果中獲得的提取物也顯示出抗彈性蛋白酶的潛力。在這個階段，研究人員確定了總酚和總黃酮含量。葉子的總酚類和類黃酮含量最高，其次是莖和漿果，酚類提取物分別為 131.53 mg CAE/g 提取物、49.96 mg CAE/g 提取物和 13.88 mg CAE/g 提取物，以及 88.64 mg RE/ g 提取物、25.10 mg RE/g 提取物和 10.00 mg RE/g 提取物分別用于黃酮類化合物。此外，黃酮類化合物占野櫻莓中所有酚類化合物的 70% 以上。所有A. melanocarpa提取物表達彈性蛋白酶抑制活性，在漿果提取物中觀察到的潛力最高（3.549 ± 0.113 mmol CAE/g 提取物）119。根據 LC-MS 分析，鐵皮樹皮和豆莢提取物是蘆丁、槲皮素、山柰酚、芹菜素、異鼠李素和紫杉葉素的來源，樣品在 250 μg/mL 和 20 μg/mL 時顯示約 36% 的彈性蛋白酶抑制豆莢提取物120% 。三種黃酮類化合物從心葉木耳葉的乙酸乙酯部分中分離出來：槲皮素、楊梅素 3-葡萄糖苷和楊梅素 3-鼠李糖苷。在無細胞和細胞模型中評估水提取物和乙酸乙酯提取物的抗彈性蛋白酶活性。在非細胞系統中，IC50水提取物和乙酸乙酯提取物的值分別達到 4.7 和 2.2 mg/L。在細胞模型中，多形核中性粒細胞受到 PMA（4β-phorbol-12-myristate-13-acetate）、CaI（鈣離子載體）和 fMLP（N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酸-苯丙氨酸）的刺激。受刺激細胞實驗中的 IC50值在乙酸乙酯提取物中為 5.9-8.6 mg/L，在水提取物中為 7.3-12.1 mg/L。在乙酸乙酯和水提取物中，活性更高的提取物是乙酸乙酯，這可能與其較高的類黃酮含量有關121。

類黃酮 SAR 分析能夠確定負責在生物體中引起目標生物效應的化學基團。SAR 可用于解釋分子結構特征對其活性的影響（圖 2），并且對于確定藥物作用122-124的潛在機制至關重要（圖 3）。

圖 2.臨床 HNE 抑制劑的化學結構。(A) MPH-966、(B) ONO-5046 和 (C) ZD-0892。

圖 3.負責類黃酮活性 (SAR) 的化學基團。

特別注意了游離羥基的數目、O-甲基化、O-糖基化以及A-環中C-6和C-8位的C-糖基化。帶有鄰苯二酚基團的天然化合物含有兩個相鄰的酚 OH 基團（3’,4’-二羥基），表現出抑制活性，這些基團之一的甲基化顯著降低了抑制活性。缺乏兒茶酚基團的化合物對彈性蛋白酶作用的抑制作用較弱125.在被研究的四種黃酮類化合物中，槲皮素、楊梅素、山奈酚和高良姜素中，主要的抑制效力是槲皮素，其次是楊梅素。值得一提的是，楊梅素分子 B 環 (C5’) 上的額外 OH 基團顯著降低了酚類抑制效力。不含兒茶酚基團的山奈酚和高良姜素沒有表現出顯著的抑制活性。此外，似乎 B 環中的 O-甲基化會導致這種活性的增加。木犀草素 4’-甲基醚 (IC50 4.13 μM) 比木犀草素 (IC506.91–36.01 μM) 具有更高的抑制潛力。此外，似乎B 環中的O-甲基化導致抑制活性增加。木犀草素 4’-甲基醚 (IC504.13 μM) 具有比木犀草素更高的抑制潛力 (IC506.91–36.01 μM)71,74。

通過分別比較芹菜素和木犀草素及其 7- O-葡萄糖苷 cosmosiin 和 cynaroside的抑制水平，可以觀察到 A-環 (C7) 和 C-環 (C3) 位置O-糖基化的重要性。基于IC50值，苷元具有更強的活性，而它們的7 -O-糖苷沒有顯著的抑制作用。值得一提的是，槲皮素和山柰酚的 3 -O-鼠李糖基化也降低了它們的活性。表 3中的值表明 C-7 或 C-3 位的葡萄糖基化或鼠李糖基化可能會產生空間位阻，阻止分子與酶126結合.此外，芹菜素和芹菜素 4’- O-β-d-葡萄糖苷的抗彈性蛋白酶潛力的比較得出的結論是，B 環中羥基的葡萄糖基化也會降低其活性70,77。

A 環的C-糖基化發生在 C6 和 C8 位置，這是類黃酮骨架中糖基自由基最典型的位置。似乎苷元木犀草素和芹菜素比它們的 8-C-葡萄糖苷表現出更強的抑制作用。另一方面，異牡荊素和芹菜素 6-C-葡萄糖苷是比它們的苷元更有效的彈性蛋白酶抑制劑（見表 3）。

抑制作用也可能與黃酮類化合物125、127的C-環中碳C-2和C-3之間的雙鍵有關。建議 C 環中的雙鍵允許維持空間和實際上平面的類黃酮骨架。雙鍵的飽和可能導致類黃酮結構中存在鈍角。先前的研究結果假設類黃酮幾乎平坦的結構是酶抑制活性的重要因素126。這些結論解釋了芹菜素的抑制活性明顯強于柚皮素（見表3）。

在雙黃酮組中，檢測了銅黃酮、阿曼黃酮、魯布黃酮和大黃酮的抗彈性蛋白酶活性（圖 4）76、84、85.Amentoflavone 和robustaflavone 的不同之處分別在于色烯環取代基C-8 和C-6。作者觀察到它們的高抑制活性可能與游離羥基部分的最佳數量有關。值得一提的是，色烯環位置的區別并不影響雙黃酮的生物效應。粗壯黃酮和大黃酮兩種結構的差異與C環雙鍵飽和有關。在 C-2 和 C-3 之間缺乏雙鍵的 Rhusflavanone 表現出比魯棒黃酮低得多的抑制潛力。該測定的結果與使用芹菜素和柚皮素的研究結果具有很好的相關性。

圖 4.具有抗彈性蛋白酶潛力的雙黃酮的化學結構。(A) Amentoflavone、(B) 魯棒黃酮和 (C) 大黃酮。

B 環在 C 環中的位置使我們能夠比較黃酮和異黃酮的活性。具有 3-B 環和一個 A 環上的羥基的染料木黃酮顯示出與芹菜素相似的活性，而在 A 環上具有兩個羥基的黃豆苷元表現出比黃酮更強的作用。然而，表 3中的數值不足以確定此類化合物的 SAR。

總之，IC50值的比較允許指出促進其彈性蛋白酶抑制的類黃酮結構的特征：B環的兒茶酚結構、C環的C2-C3之間的雙鍵、A-、B的O-甲基化和C-糖基化- 和 C 形環。據報道，植物衍生物對 HNE 的活性水平也與這些衍生物的疏水性和摩爾折射率有關，雙線性相關性代表最重要的關系128。然而，為了將 SAR 與類黃酮抑制作用聯系起來，必須在不同的細胞和酶系統中進行額外的實驗。

在發現天然產物作為酶抑制劑方面取得了重大進展。天然化合物的高潛力在于它們作為先導結構的作用，可以在生物利用度和生物活性方面進行優化。然而，我們關于各種黃酮類化合物的 SAR 及其對彈性蛋白酶作用和釋放的影響的知識仍然不完整。關于各類化合物活性的新報告提供了有關新型彈性蛋白酶抑制劑的信息。另一方面，現有的結果產生了關于其抑制活性水平的相互矛盾的信息。

為澄清起見，本綜述的作者驗證了確定表 3中化合物 IC50值的方法標準。例如，描述木犀草素活性的研究中IC50值之間的差異可能與涉及阻斷中性粒細胞釋放彈性蛋白酶以及抑制已經釋放的酶的實驗有關。有人指出，IC50木犀草素活性 > 300 μM 在測試中確定，它代表了在將酶添加到底物和孵育過程后測得的吸光度變化。相比之下，彈性蛋白酶的釋放是通過嗜天青顆粒的脫粒和用 fMLP 激活人中性粒細胞來測量的。結果在 fMLP/CB（細胞松弛素 B）激活的無藥物對照系統中表達。在這種情況下，木犀草素活性的 IC50達到 6.91 μM。相應地，另一種在植物界常見的黃酮，即芹菜素，已被測試為彈性蛋白酶抑制劑，其 IC50范圍從 13.35 μM 到 46.1 μM。在用 fMLP 刺激細胞后，芹菜素會有效抑制 HNE 的釋放。這些結果與使用木犀草素作為抑制劑獲得的數據一致。據推斷，涉及 fMLP/CB 刺激的中性粒細胞的實驗表明芹菜素和木犀草素是有效的。對白楊素IC 50值的分析也可以得出類似的結論。人類嗜中性粒細胞中白楊素的優異活性被評估為抑制 fMLP/CB 誘導的彈性蛋白酶釋放 (IC50=2.44 μM)。

槲皮素已在許多研究中用作參考化合物，已證明對彈性蛋白酶有抑制作用。基于這些結果，可以充分描述槲皮素 IC 50的值似乎在 2.6–2.65 μM 范圍內。然而，一些研究人員為此化合物建立了超過 300 μM (0.101 mg/mL) 的陽性對照。在這種情況下，所得值之間的區別似乎與底物濃度（N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-p-硝基苯胺，彈性蛋白酶）、pH 值、孵育時間和溫度以及彈性蛋白酶的體積有關，抑制劑和介質溶液。

此外，5,6,7-三羥基黃酮黃芩素不僅與胰彈性蛋白酶的活性位點結合，還與胰彈性蛋白酶的變構位點結合，表現出競爭性和非競爭性抑制模型，這表明抑制劑分子可能與酶中的任何一種結合。 -底物復合物或單獨的酶80。根據現有數據，黃芩素具有顯著的抗彈性蛋白酶作用（IC50=3.53 μM），盡管研究也表明缺乏相關的抑制活性。這些極端結果值之間的區別可能與所進行實驗的不同條件有關。總之，為了指定抑制彈性蛋白酶活性或其從細胞中釋放的能力，需要廣泛的必要實驗條件（包括底物、pH 水平、孵育時間、波長、體積、濃度以及酶釋放或游離酶活性的抑制) 應予以考慮。

上述數據突出了天然酚類結構作為彈性蛋白酶抑制劑的多樣性，因此表明可以基于酚類化合物的結構設計和開發新型合成抑制劑。在實踐中，每種療法的相當一部分是藥物對其靶點的選擇性。另一方面，化合物也可能由于其毒性和副作用而顯示脫靶結果。抗靶向作用遵循功效和毒性劑量之間的狹窄水平，這引發了候選藥物化合物開發的問題。可以用計算機建立蛋白質-配體相互作用評估虛擬篩選和對接。可用的理論技術提供了有關化合物的基本信息，并展示了計算其對 HNE 129、130 的結合親和力的方法。結構形狀虛擬篩選對于從數據庫中識別選擇性類黃酮抑制劑可能是實用的。分子對接是一種工具，可以預測潛在的抑制活性，并更好地表明類黃酮如何影響其酶靶標131。理論方法和計算程序，包括虛擬篩選、結構基礎和藥效團分析以及分子對接，可用于挑選靶向酶的化合物并確定已知和新發現的植物化學物質的預期目標132.因此，計算機研究可以改進連續階段，以減少脫靶效應、活性分析和天然化合物的進一步分析。建議使用體內和體外確定所述抑制劑的功效和安全性，尤其是在產品中使用此類化合物以促進健康時。