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單陽管的設定標準是什么？羅工來告訴你 現在很多老師都知道光譜重疊會導致不同熒光通道間干擾，通過補償調節可以將干擾信號減去，從而保證流式分析結果的正確。但是用來調補償調節的單陽管很多同學不知道怎么設定 以及有哪些要求，這一期羅工將詳細的給大家分享經驗內容。 簡單說，單陽管其實就是只加一種熒光抗體的樣本管，比如你的樣本有三種熒光抗體染色（FITC， PE， APC）。除了被檢測樣本外，另外還需要4個管子，一個是無染色的，一個是FITC陽性染色，一個是PE陽性染色，還有一個是APC陽性染色 在制備單染管時有哪些要求呢？ （1）、單染管和樣本管的樣本類型要保持一致，并且盡量選擇處理的樣本，保證有明顯的陽性峰和陰性峰。 （2）、用來調節補償的抗體必須與實驗用的抗體熒光素一樣。 （3）、單染管和樣本管的操作方法要保持一致。例如檢測胞內因子時，如果樣本管進行了固定破膜，那么單染管即使是表面染色，也需要進行固定破膜。 （4）、單染管各個熒光通道的電壓需與正式上樣時的電壓保持一直。 解釋：熒光素的MFI值會因為電壓的改變而改變，從而無法正確計算補償值。 很多老師反饋說當marker豐度比較低時陽性群表達量低，很難準確區分陰陽性峰。特別是某些探索性實驗。實驗者本身不知道某些蛋白的表達情況，那這個時候應該怎么辦呢？ 我們可以選擇用補償微球代替細胞來制備單染管，商品化的補償微球是聚苯乙烯微粒，用于優化熒光補償設置。一般有陰性珠子和陽性珠子。充分混合后和抗體孵育，將得到陰性和陽性群比例一定的單染管。 補償微球優點：（1）節省樣本，不必使用有價值的細胞或者組織樣本 （2）制備相對簡單，大大減少工作量 （3）陰陽分群明顯，避免了弱陽性樣本信號不夠強的問題。
缺點：（1）有一些抗體無法用補償微球進行染色。比如FVS系列死活染料就無法與補償微球結合。（FVS染料與氨基結合） （2）大多數情況下，用補償微球計算的陰陽峰MFI相對值(Positve/negative)比樣本管要大。 解釋：補償微球的陰性峰的MFI值在大多數情況下小于樣本單染管，是因為補償微球表面不會表達FcR受體，所以補償微球的陰性珠子不會與抗體產生非特異性結合。但微球的陽性珠子和抗體結合后都會表現出強陽性，而這是一般生物樣本無法達到的強度。如下圖不同單染管在電壓相同的情況下MFI值的差異。 那我們如果選擇補償微球制備單陽管時，又有哪些注意事項呢？ （1）使用要陰性和陽性珠子要混合均勻。 （2）補償微球的直徑顆粒度都小于大多數免疫細胞，如果閾值設置過大或者FSC/SSC電壓過小，都會采集不到信號。如圖為電壓相同的情況下不同單染管的散點圖。
（3）補償微球上機時的電壓應該按照其本身的電壓設置，因為補償微球的陽性峰都非常強，某些弱陽性實驗樣本的電壓值套用到補償微球上會讓補償微球的陽性峰（特別是PE這種比較亮的熒光素）超出動態范圍。 （4）補償微球不是能和所有的抗體結合，所以要依據抗體來源選擇。 很多老師應該都提出過這樣的疑問——單陽管是不是第一次建立模板時需要制備，后面實驗就直接調用歷史補償呢？ 如果Panel比較復雜是不推薦這樣做的，因為調用歷史補償后都會存在過度補償或者補償不足的現象。特別是Panel超過十色的情況下。下圖為調用歷史補償后的結果圖。這種單通道補償不準確的結果會不斷累加，造成細胞群分布混亂。 那針對這種情況我們應該怎么改進呢? （1）單陽管應該以樣本為主，少數弱表達marker使用補償微球進行補充。 （2）為了確保計算的補償值正確，我們可以先圈出上一級細胞群，再從該細胞群分出陰陽群體。 （3）應用自動補償后最好再觀察每個通道熒光溢漏情況，再結合手動補償進行微調。例如下圖是在自動基礎上再手動進行調整的 （4） 歷史補償值調用必須建立在電壓，光學濾片，光路聚焦都沒有任何改變的前提下。對于多色的樣本，在調用的同時最好進行微調。
很多老師應該都遇到這樣的現象，雙參數熒光圖在補償調節后，大量的細胞群“下沉”至0值下方，無論怎樣調動坐標也無法將這部分細胞群顯示出來。只有打開Biex后才能顯示完整的細胞群這是為什么呢？
那在實驗中應該怎么避免造成這種誤差呢？ （1）盡量選擇不同激光器激發的熒光素，可以最大限度的避免補償。
（2）同一激光器下盡量避開選擇光譜嚴重的重疊的熒光素，比如BV605和bv650，APC 和AF700。 （3）補償值理論上不會高于100%，如果超過可查看某些復合染料是否在染色過程中發生了部分斷裂，并確認通道的電壓是否在合適的范圍。 （4）補償值如果出現負值且低于-1時，有可能是某些通道“過補償”造成的。 正確設置單染管并精準分析，我們的實驗結果才會驚艷，本期的羅工秘笈到這里也告一段落了，如果大家有其他的心得體會，也歡迎各位老師在留言區進行分享哦~ |
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