 人間充質干細胞（human mesenchymal stem cells, hMSCs）由于其再生和免疫調節特性，以及能夠遷移到損傷的確切部位，在現代治療和再生醫學中發揮著重要的作用；這些特性使hMSCs成為目前在開發創新細胞治療產品中具有前景的活性細胞之一，已應用在糖尿病、燒傷、骨關節炎、移植物抗宿主病等特定疾病治療上。 目前，全球基于hMSC的細胞治療產品有500多項正進行臨床試驗，以評估其安全性和副作用，確定其劑量和給藥途徑，并檢視其作為特定疾病的療效。然而，只有8種基于hMSC的產品獲得了上市營銷。 鑒于近年來hMSC臨床試驗數量的快速增長和這些產品的復雜性，以及它們的細胞組分特征和藥物產品狀態，需要更嚴格、更具體、更統一地要求定義hMSCs的質量，并加強其安全性和有效性的分析。這些質控管理與分析應在整個制造過程中實施，以確保hMSC的功能和完整性，并保證每批次生產始終符合規范。因此，正確設計生產制造過程對于授權hMSC產品上市至關重要，最終產品的質量、安全性和有效性可以得到保證，然后才能作為醫療產品在人體內使用。   hMSC的產品制造過程包括不同階段：供者選擇和評估（異基因療法）、血清學檢測、活檢、分離、生物樣品處理，必要時通過體外擴增獲得預期的細胞數量，中間產品和最終產品的鑒定、包裝和放行(下圖)。hMSC產品制造過程需符合GMP生產規范。GMP確保hMSC產品始終按照質量標準制造和管控，同時將細胞制造過程中被傳染源污染的風險降到最低。除了質量控制程序和風險評估，其他制造方法應與設施一起到位和驗證，如體外擴增過程、清潔、環境監測、運輸、材料消毒、培養液填充等。操作人員尤其需要經過嚴格訓練，以獲得操作資質。因此標準化操作程序與環境是非常必要的。 hMSC的產品制造過程 供者選擇與血清學檢測 hMSC產品制造過程的第一步是選擇供者（異基因產品），然后通過供體測試來檢查生物起始材料，包括自體和異基因hMSC產品。每位捐贈者必須接受體格檢查，以排除傳染病的跡象或癥狀。此外，還應進行血清學研究，至少檢測人類免疫缺陷病毒（1型和2型）、肝炎病毒（B型和C型）和梅毒螺旋體。美國FDA還要求排除一些相關疾病，如西尼羅河病毒(West Nile Virus)、敗血癥(sepsis)和痘苗 (vaccinia)。 在大多情況下，hMSC產品的臨床應用涉及大量細胞的給藥劑量。骨髓、臍帶和脂肪組織是常見的獲取hMSCs的組織來源。然而，hMSCs的分離技術因細胞來源的不同而不同。因此，有必要開發有效的hMSC分離和體外擴增方法，以獲得預期的細胞數量。常見分離hMSCs的方法，包括組織塊貼壁法、紅細胞溶解法和梯度密度法。骨髓來源的干細胞通常被視為金標準。然而從骨髓或臍血中獲得的hMSCs的百分比相對低，因此通過微創方法獲得脂肪組織，再經過密度梯度離心分離MSC是目前值得注意、簡單而經濟的方法，以提高hMSCs的產量。 但為獲得可供給藥劑量，分離后的hMSCs必須經過體外大規模擴增。而體外擴增過程涉及對hMSCs的實質性操作，這可能對細胞的生物特性、生理功能和結構特性進行重要的改變，因此是hMSC產品生產過程中一關鍵階段。以往使用胎牛血清(FBS)培養hMSCs，因含有潛在風險，如人畜共患傳染源、微生物污染物和免疫反應，目前已避免使用；朝無血清細胞培養（serum-free cell culture）(StemMACS MSC Expansion Media Kit XF, 130-104-182) 方向發展。無血清條件下用以擴增hMSC的人血小板裂解物（human platelet lysate, hPL）可通過全血來源的血小板濃縮物或經陽性紅細胞抗體篩選后的血小板分離法獲得。人類血液病原體（如病毒、細菌、真菌和朊病毒）的傳播風險可在hPL生產過程中進行病毒滅活處理，以確保最佳安全性。因此，人血小板裂解物（hPL）可作為FBS的替代品用于臨床級別的細胞治療。 通過標準化和一致性的方法，定義、監測和質量管控每個hMSC產品中存在的細胞成分，以確保最終產品的質量、安全和有效性。因此評估hMSC細胞特性、活性、純度、潛能、擴增能力、基因穩定性、致瘤性與療效是基本條件。此外，依據GMP規范，在體外擴增過程中，細胞應該受到監控分析產品是否受到污染。為確保hMSC的產品在制造過程中不會受到感染，hMSCs在分離階段、參考樣品（reference sample）、中間產物、最終產物、保留樣品（retention sample）、種子細胞庫（master cell bank）和工作細胞庫 (working cell bank)等均需執行質量管控。
臨床級hMSC生產過程質量管控 hMSC細胞凍存 hMSC可以新鮮使用，或在同種異體治療情況下可將細胞凍存備日后使用；目前超過三分之一的hMSC臨床試驗使用冷凍保存的細胞。因此，諸如冷凍保存（cryopreservation）和解凍（defrosting）方法、最大凍存時間和激活細胞的過程是至關重要的，均須在制造過程中進行驗證和界定。 低溫保存技術(cryopreservation technique)是基于稱為低溫保護劑（cryoprotective agents，CPA）小分子進入細胞，防止細胞內形成冰晶與抵抗降溫過程產生的滲透壓力，來保存細胞。hMSCs最常用的凍存液是以DMSO降低凍結點(freezing point)以及動物血清或無動物成分的凍存液（StemMACS? Cryo-Brew, 130-109-558），以在緩慢凍存過程中（1-2.5°C/min）保存hMSCs的功能和活性。此外，凍存hMSCs的細胞密度也取決于下游的應用。大多數臨床方案建議靜脈注射100-200x104 cells/kg，或皮下或心肌內注射1.2-6x108 細胞。因此，hMSCs通常被冷凍在濃度為200-2500x104 cells/ml、總體積為1ml的冷凍管中。 hMSC終產品需依據制造的劑量表和給藥途徑分為初級包裝（如袋或注射器）和次級包裝（如標簽、盒子、傳單）。 在這一階段，應進行穩定性測試，評估和確定最終產品在整個儲存和運輸過程中的最佳儲存條件，以保持其完整功能不變。終產品由hMSCs、賦形劑、其他類型的細胞，甚至與醫療器械結合而成。穩定性測試可以計算hMSC終產品的保質期，可以儲存hMSC終產品的最長時間，在給患者使用之前保持其特性。  hMSC產品放行 hMSC產品制造過程的最后階段是根據產品規范中定義的要求放行產品。產品規格表需準確地描述hMSC產品必須滿足的驗收標準、分析技術和分析方法。細胞特性、活性、純度、潛能、增殖能力、基因組穩定性和微生物檢測均須在hMSC終產品規格表中明確標示。一旦獲得所有結果，就可進行最終放行。 在最終產品放行之前，應將大量等分樣品冷凍保存（保留樣品），作為再分析的備用，供管理存儲和發送hMSC產品。最后這些階段也必須加以控制，以確保良好分銷規范 (Good Distribution Practices, GDP)。 現今hMSCs應用受到許多臨床前和臨床研究，評估其安全性和療效以用于不同的疾病上的治療。然而他們的作用機制、最大劑量、以及理想的給藥途徑、以及何為準確的質量控制以及何時必須進行質量控制仍是需要解決的問題。因為這些因素將影響hMSC產品的價格，從而影響其在市場上的可及性。因此，基于hMSC的臨床產品生產製造過程的開發是一個不斷發展的領域。 為幫助鑒定人間充質干細胞，國際細胞治療學會（ISCT）在2006年提出了三個最低標準：
Relevant markers in MSC Phenotyping Kit, human (130-125-285)
參考文獻: Principal Criteria for Evaluating the Quality, Safety and Efficacy of hMSC-Based Products in Clinical Practice: Current Approaches and Challenges. Pharmaceutics. 2019 Oct;11(11). pii: E552. doi: 10.3390/pharmaceutics11110552. 美天旎中國 在看點這里 |
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