iMeta | 南科大宋毅組綜述逆境脅迫下植物向微生物組求救的遺傳基礎

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引  言

全球氣候變化增加了農業生產相關的脅迫發生的頻率，同時伴隨人口的增長使得全球糧食供應面臨巨大挑戰。現代農業中農藥和化肥的施用顯著提高了作物產量，但也產生了大量環境問題。因此，可持續農業發展需要新型的環境友好型生物技術來支持。植物(宿主)相關微生物群所攜帶的功能基因通常比宿主多10-100倍，這顯著提高了植物-微生物共同體(宿主及其相關微生物群)的遺傳和代謝潛力。因此，設計能招募緩解植物脅迫壓力并促進自身生長的微生物群將是幫助其對抗多種脅迫的環境友好型方式。然而，由于不同地區土著微生物群落以及土壤異質性的較大差異，在田間直接施用單個或多個有益菌株組合所產生的生物及生態學效應是不穩定的。探究脅迫誘導下植物介導的對自身菌群的動態調控的遺傳和分子機制，將有助于未來設計能及時、穩健地招募對緩解脅迫有利的微生物群的抗逆作物。

在過去數十年里，植物逆境生物學研究主要聚焦在非生物和生物脅迫響應中的內源遺傳調控因子的作用上，如相關激素，(動植物)膜或胞內定位的免疫受體等 (圖1)，但植物相關微生物在其脅迫響應中的作用研究較少。植物可以向根際分泌約20-40%的光合固定碳源，并選擇性地形成具有高度微生物多樣性的根相關微生物群(含根際、根表和內皮層組分)，且據報道，每克根際土壤10³-10⁴個OTU (操作分類單位) 和10⁷-10⁸個CFU (菌落形成單位)。高通量測序技術的發展革新了現代微生物生態學研究。例如，針對細菌16S rRNA基因或真菌ITS基因變異區域的擴增子測序可以提供微生物群落的分類以及相對豐度信息。宏基因組測序可以進一步提供高分辨率的微生物組的分類和功能信息。目前，植物遺傳突變和微生物組測序相關分析表明，植物免疫激素(尤其是水楊酸)信號可影響微生物群的組成，且專門的三萜代謝物也會塑造擬南芥根系特異微生物群的組成。精確的突變體篩選實驗也證實了植物遺傳因子(尤其是免疫基因)參與特定微生物群落的形成，但要確定微生物組的變化是否會導致植物適應性的相應變化仍然是一個挑戰。本研究回顧了已知的與植物主動重塑(脅迫響應或有助于植物緩解脅迫相關的)微生物群(“求救”)相關的遺傳調控因子，并總結了可用于確定微生物群變化與植物特定功能性狀之間因果關系的實用手段。

圖1. 植物提升逆境耐受性的新視角：重塑緩解逆境的微生物群

為了抵御陸地生態系統中的生物和非生物脅迫，如病原體感染，昆蟲取食，營養缺乏(缺氮、磷和鐵等)，干旱，弱光或遠紅光條件(遮蔭)等，植物進化出了復雜的遺傳調控因子。目前植物內部的逆境響應途徑已被廣泛研究(黑色箭頭)。例如植物主要利用免疫激素(水楊酸SA、茉莉酸JA)來抵御病原體感染，而脫落酸(ABA)和乙烯(ETH)則作為主要的非生物脅迫響應激素。植物膜(FLS2，BAK1)或細胞質定位免疫受體(NLR，TLR)介導微生物相關分子模式或病原體效應因子的識別，從而增強植物在被感染時的免疫應答。此外，一些新的研究表明多種植物基因(如MYB72、NRT1.1B、FERONIA、PHR1、F6'H1、HY5等)參與了根際微生物群的重塑，這可能是植物進化過程中一個新的逆境適應策略。

植物介導的微生物群在各種脅迫下的變化

●  生物脅迫富集根際熒光假單胞菌及其潛在調節因子

自19世紀初以來，研究人員發現土壤微生物具有對抗病原體的潛力。例如，病原體感染和小麥單作可以形成“抑病土壤”(Disease-suppressive soil)，并能降低后代植株生長中的病害發生頻率。此外，通過滅菌可以抑制土壤這種抑病特性，且這種抑病特性還可以通過將0.1–10%的抑病土壤遷移到其他土壤中來轉移 。這形成了一種假說，即病原體感染會觸發宿主信號，在根際招募有益微生物(“呼救”假說，“Cry for help”)。長期以來，人們發現假單胞菌在多種病原相關的抑病土壤系統中富集，并通過多種機制抑制土壤病害。微生物高通量測序結果廣泛證實了病原感染后微生物菌群的急劇變化，并且發現假單胞菌屬廣泛富集。例如，枯萎病感染會影響辣椒相關微生物群的組成、功能和共生模式，并導致假單胞菌、鏈霉菌和芽孢桿菌的富集。變形菌門(包括假單胞菌)、厚壁菌門和放線菌門等與甜菜絲核菌感染后的土壤病害抑制有關。宏基因組測序結果顯示，立枯病絲核菌感染后，假單胞菌科、幾丁質噬菌體科和黃桿菌科會在根內富集。值得注意的是，地上昆蟲(粉虱)感染也會引起根相關微生物群的變化，并在根際招募熒光假單胞菌。此外，有研究指出根中的線蟲感染也會導致假單胞菌富集和抑病土壤的產生。抑病土壤中富集的假單胞菌之所以可以直接或間接地賦予土壤抑病特征。作為植物根系強有力定殖者，它們首先可以直接與病原體競爭定殖和根際營養，此外假單胞菌產生的吩嗪和2，4-二乙酰氯葡糖醇等次級代謝物也可拮抗病原真菌生長。

最近一些研究提供了有關假單胞菌在根際定殖機制的新見解。基于遺傳篩選的結果表明，具有多種功能的受體激酶FERONIA(FER)，通過調節鳥苷三磷酸酶(GTPase)ROP2并維持根系內的基礎活性氧(ROS)水平，進而負調控假單胞菌在根際的定殖。值得注意的是，ROP途徑也參與調控大豆與根瘤菌共生，這表明GEF-ROP系統在植物進化及與共生微生物相互作用中起著關鍵作用。ROS在調節假單胞菌定殖中的作用得到了多項研究的支持。例如，過氧化氫酶活性缺陷的假單胞菌突變體(katB，解H2O2)也表現出根際適應性的缺陷，并且將過氧化氫酶應用于根際可增強部分假單胞菌的適應性。有趣的是，真菌病原體鐮刀菌(Furasium)和一些線蟲都能分泌RALF肽(FER的配體肽)類似物來增強毒力，這表明病原體中RALF的產生與FER介導的假單胞菌定植調節之間存在聯系。這些證據為抑病土壤的起源提供了合理的解釋，即植物可以感知病原體分泌的RALF(可能與其他感染/損傷信號一起)，進而招募假單胞菌。事實上，RALF23處理也導致了擬南芥根際富集假單胞菌，但該途徑在多大程度上介導了病害誘導的植物“呼救”以及假單胞菌的富集，仍有待于在田間種植的作物中進一步研究。

●  營養脅迫和微生物群變化之間的協同調控因子

土壤養分含量或可利用性直接限制作物的生長、產量和質量，目前已有研究鑒定了植物養分匱乏時主動重塑微生物群的內源信號調控因子。一般地，植物根系主要吸收無機氮(硝酸鹽和銨)而不是有機氮，土壤微生物群落會影響土壤有機氮和無機氮之間的平衡進而影響氮的可利用性。自然條件下，水稻(Oryza sativa L.)秈稻品種比粳稻品種具有更高的氮利用效率，部分原因就是由于秈稻品種含有更多與根相關且具有豐富氮代謝相關功能的微生物群落。進一步研究顯示，水稻中氮同化過程的主要轉運體NRT1.1B，參與形成水稻根際氨化功能相關的微生物組(圖1)，宏基因組測序結果也顯示，nrt1.1b突變體具有較低豐度的與氨化功能相關的微生物群。這些結果作為遺傳證據，證明了在水稻長期進化過程中，NRT1.1B可選擇性地形成有利于氮同化的有益微生物群。玉米根系轉錄組和微生物組分析表明，類黃酮生物合成相關基因(如I2型類黃酮合酶，FNSI2)的表達與草酸桿菌科的相對豐度之間存在相關性，進一步研究結果證明了玉米可以合成黃酮來豐富根際草酸桿菌科植物，并在植株面臨氮饑餓時促進其生長和氮素獲取。

盡管土壤中鐵含量豐富，但在中性和堿性土壤中鐵的溶解度均較低，因此對于植物來說可利用程度較低。植物進化出了復雜的鐵饑餓響應途徑，例如，通過根際酸化來增加三價鐵的溶解度，并分泌一系列次級代謝產物，如香豆素(含scopoletin，fraxetin 和sideretin)等來促進鐵同化以及調控微生物群。MYB72是鐵饑餓條件下誘導植物香豆素生物合成的主要調控因子，MYB72和FERULOYL-COA 6-HYDROXYLASE1(F6'H1，東莨菪內酯合成酶)缺陷的突變體均在植物缺鐵時觀察到根際微生物群組成的顯著改變(表1)。這可能是由于東莨菪內酯可以選擇性地抑制真菌病原體的生長，而對促進生長的假單胞菌幾乎沒有影響。另一項在可控平板系統中的研究通過利用含有22個株系組成的合成微生物群，證實在了缺鐵條件下f6'h1突變體會顯著影響根際微生物群的組成，且發現香豆素可以觸發細菌中ROS脅迫以發揮抗菌活性。這些研究表明，植物在鐵饑餓時可以分泌有抗菌效應的香豆素來重塑微生物群，但微生物群的變化具體如何緩解鐵脅迫的機制尚不清楚。最近的一項研究表明，在缺鐵條件下接種合成菌群(從擬南芥根際分離的115株菌株)可以提高野生型擬南芥的鐵含量和鮮重，但在香豆素生物合成缺陷突變體中沒有表現。這說明香豆素誘導的微生物群落變化而非原始微生物群本身可以有效緩解植物鐵饑餓脅迫。同時，轉錄組分析結果顯示，SynCom接種可緩解低鐵條件下的缺鐵響應，而具有鐵吸收缺陷的突變體也會阻斷SynCom介導的對鐵饑餓響應的緩解。這些證據進一步確認了香豆素誘導的微生物群變化主要通過直接提高鐵的利用效率進而緩解植物鐵脅迫響應，而不是通過促進根系中的鐵同化相關途徑。總的來說，這些研究詳細描述了植物重塑微生物群以緩解鐵饑餓的途徑，并為植物營養脅迫下相關“呼救”機制的系統性研究提供了范例。

土壤中存在大量總磷，但植物只能吸收正磷酸鹽。與細菌對植物根系中鐵同化的促進作用相反，細菌會與植物競爭正磷酸鹽，并降低土壤中正磷酸鹽的含量。PHR1作為磷酸鹽饑餓反應的主要調控因子，在磷酸鹽饑餓時協調植物與根際微生物群的相互作用。研究表明，一系列磷酸鹽饑餓調控因子或磷酸鹽轉運蛋白缺陷的突變體會顯著改變植物根際微生物群(表1)，且植物與共生真菌的聯系也受磷酸鹽饑餓信號的調控。例如，只有在磷酸鹽饑餓條件下擬南芥才能與具有促生效應的內生真菌炭疽菌(Colletotrichum tofieldiae)(協助將磷酸鹽轉移到植物中)建立有益共生關系。這是因為與磷酸鹽饑餓相關的吲哚硫甙的產生可以阻止炭疽菌的過度生長，進而限制炭疽菌在根際的定殖，這對互惠共生至關重要。磷酸鹽饑餓(PHR1)或吲哚硫甙合成的一些調控因子(MYB34，MYB51，MYB122三重突變體)也參與維持這種有益的共生，研究發現這些調控因子的突變體可以阻止磷酸饑餓條件下炭疽菌介導的植物生長促進作用。對植物來說，招募菌根真菌是一個高能耗的過程，因此受到植物自身的嚴格調控。據報道，水稻中與有益菌根真菌的關聯也受到磷饑餓調控因子PHRs的正向調控，這使得水稻能夠在缺磷時主動促進共生，并通過菌根真菌間接的吸收磷。這些研究表明，植物與真菌共生受到自身嚴格且適時的控制，并取決于磷酸鹽狀態。

表1.  植物在抵抗逆境脅迫過程中重塑微生物群落的相關研究

營養脅迫下植物及其相關微生物群落的相互作用研究表明，營養穩態與根系相關微生物群之間存在普遍的相互作用。事實上，增強或破壞根系擴散屏障(凱氏帶和木栓質沉積物)的突變體同時影響離子組和根相關微生物組。同時，大量根相關的分離細菌可在在根中誘導木栓質沉積或凱氏帶的形成并影響根系離子組的構成和在不同礦質營養脅迫下的適應性。這些研究表明，根系和微生物群成員之間通過廣泛的相互作用，從而影響根系擴散障礙、養分穩態，并最終影響植物的適應性。

●  與地下微生物群的協調合作以適應光脅迫

作為光合作用的能量來源，光照也是植物協調生長、防御和與微生物群相互作用的關鍵信號。植物已經進化出復雜的光敏系統來感知光強和光質，包括用于紅光的光敏色素系統和用于藍光的隱色素(CRY)系統。最近一項研究表明，根瘤菌在大豆根部定殖后，需要在地上部分進行光照才能成功結瘤，且與紅光相比，藍光對促進根結瘤的作用更強，藍光受體CRYs在大豆中的過度表達能夠顯著促進結瘤。這一過程受光誘導的GmSTF3(擬南芥中光形態發生的主要轉錄因子HY5的直系同源蛋白)和GmFT2a從芽到根的易位調節。根瘤菌激活鈣/鈣調素依賴性激酶GmCCaMK磷酸化GmSTF3，促進GmFT2a和GmSTF3之間的相互作用，形成轉錄激活復合物，并進一步促進與結瘤相關基因的表達。由于根瘤菌的結瘤和共生是一個消耗能量的過程，需要足夠的光合作用固定能量，因此GmCCaMK-GmSTF3-GmFT2途徑允許植物根據地上部光照的可用性精確地調節根系與根瘤菌的結合。因此，進一步測試GmSTF3-GmFT2途徑是否廣泛影響整個根際微生物群落組成將是很有趣的研究。

在自然狀態下中，遮蔭(弱光強度或長波長光)等不利光照條件是高密度環境中常見的光脅迫，很容易導致“避蔭綜合征”并抑制植物生長和免疫。有研究指出，地上遮蔭作用(低光強度和“黃昏階段遠紅光處理”)可以重塑具有生長促進作用的微生物群落(如假單胞菌的富集)。接種人工SynCom后，在蔭蔽處的植物生長狀況以及對病原菌的抗性都較無菌環境下生長的植物有所增強。光感受器(CRY1CRY2)或茉莉酸，赤霉素和油菜素類固醇信號等調控因子缺失的多個突變體均會顯著影響遮蔭誘導的微生物群動態，并且基于距離量化(PCoA)的差異也與遮蔭下微生物群介導的生長促進作用具有相關性。這強烈表明植物遺傳途徑(感光和激素信號)的參與改變了遮蔭脅迫下的微生物群組成，從而促進了生長。

●  代謝變化與干旱誘導的根系微生物群變化有關

干旱會導致微生物群落組成發生劇烈和保守的變化。例如，對18種系統發育關系較遠的植物物種的微生物組譜進行分析，發現干旱時細菌群落組成發生了保守的變化，如放線菌，尤其是鏈霉菌屬菌株的富集。值得注意的是，不同的植物物種根內鏈霉菌的相對豐度都與其耐旱性相關。多項研究發現，接種鏈霉菌可以促進干旱脅迫下的作物生長及產量。在半無菌體系中的研究進一步證實了干旱誘導富集的鏈霉菌菌株與干旱脅脅迫下的植物生長促進關系。這些證據表明，干旱誘導的微生物群變化(尤其是鏈霉菌的富集)可以緩解植物的干旱脅迫。此外，一種有益真菌-印度梨形孢真菌(Piriformospora indica)，從沙漠植物根際分離而來)可以增強植物對多種脅迫(如干旱和鹽堿等)的耐受性。印度梨形孢真菌的定殖會促進植物根內抗菌化合物-植保素(camalexin)的生物合成，但干旱響應激素脫落酸(ABA)抑制植保素生物合成進而促進其定殖。這些證據表明，干旱促進了印度梨形孢真菌在植物根際的定殖，以增強自身對于逆境的適應性。

干旱的影響也取決于干旱脅迫的發生時間和持續長度。例如，與開花后相比，干旱脅迫對開花前植物根際微生物群落的影響更大，而長期干旱會導致根系內生微生物群落中富集鏈霉菌的持久“記憶”變化，即使在復水后也無法恢復。近年來多組學整合分析(全息組學)極大地加深了我們對干旱脅迫下植物介導的微生物群變化的理解。研究表明，干旱脅迫下植物根系相關的微生物群的變化遠遠大于非根際土壤(Bulk soil)以及牙簽(模擬死根)等相關微生物群的變化。代謝分析結果表明，干旱下甘油-3-磷酸(G3P)在根中顯著富集，且轉錄組數據顯示，碳水化合物、氨基酸轉運和代謝相關基因在根相關微生物群中高度表達。一項研究展示了干旱脅迫下根和土壤相關的55個宏基因組重組基因組草圖(MAGs)，并對干旱富集型和非富集型放線菌相關MAGs進行了比較，發現在干旱富集型基因組中鐵轉運和代謝相關功能基因更豐富。這表明植物對于缺鐵的響應與干旱下放線菌的富集有關。相同地，在無干旱脅迫下，存在鐵載體轉運缺陷的玉米tom1突變體在抑制自身對鐵的吸收的同時也導致了根際放線菌的富集。此外，鏈霉菌科的相對豐度在f6'h1突變體(阻止鐵轉移相關的香豆素的生物合成，并降低植物在鐵饑餓土壤中的適應性)根際中顯著較高。這些研究均證實了植物效應(尤其是缺鐵響應)與干旱誘導的微生物群變化有關。

確立植物介導的微生物群變化對植物表型影響的方法

●  微生物豐度與植物表型之間的相關性

我們可以首先量化特定分類群(依賴培養或不依賴培養)的豐度與所關注的宿主性狀之間的數學相關性(圖2a)。例如，干旱后植物內生鏈霉菌相對豐度與不同植物物種的干旱耐受性顯著相關。這表明鏈霉菌的富集有助于植物緩解干旱脅迫。根際中有益的熒光假單胞菌數量可以通過計算King’s B培養基(一種用于檢測假單胞菌的培養基)上的熒光菌落來直接量化。這已被用于驗證植物根際熒光假單胞菌水平與其生長促進效應之間的顯著相關性。盡管此方法只揭示了相關性效應，但它為下一步更具說服力的相關關系的系統驗證提供了線索。

圖2. 屬水平微生物組成及層次聚類分析

(A) 對于假單胞菌或其他易分離和量化微生物的突變體，可在不同處理組中直接量化CFU。如感興趣菌株的豐度與植物性狀(鮮重或其他脅迫響應相關指標)有關，便為建立微生物變化與植物表型之間的聯系提供了初步線索。對于大多數不易分離和鑒定的菌株，可以根據微生物組測序結果(如相對豐度)或物種特異性標記基因的qPCR結果來分析其與所關注性狀的相關性；

(B) 植物-土壤反饋(PSF)系統可用于確定微生物群的動態變化是否導致了植物特定表型(如生長促進或逆境耐受性提升)。圖中綠色細菌代指具有生促進長促進作用或其他有益的細菌，由初代植物富集；

(C) 基于SynCom的微生物群移植試驗可用于確認微生物群落變化與特定表型間的因果關系。如圖所示，植物菌群失調會導致葉片或其它組織出現病態表型。為確認因果關系，可以從健康和失調群落中分離菌株，并進行SynCom移植，以確定特定微生物群移植是否會讓植物產生和含有失調微生物群的原始植物相同的表型。基于SynCom的方法具有較強的靈活性，可進行單一菌株(單關聯)篩選或組合感興趣的菌株模塊。

●  植物-土壤反饋系統

與非根際土壤相比，植物可以選擇性地塑造獨特的根際微生物群，因此，初代植物可以改變土著微生物群落，并為后代植物保留持久的微生物“遺產”。這種現象被稱為植物-土壤反饋(PSF)，可用于檢測微生物群落變化是否會導致后代出現某些特定表型(圖2b)。此前的研究表明，第一代擬南芥受霜霉病病原體感染后可在根際富集抗病有益微生物，進而增強第二代植物在相同土壤中生長時的抗病性。然而，PSF效應也可能來自土壤養分的變化，因此，還需要另外兩種途徑來進一步確認微生物群變化對PSF的主要影響：1)確保第一代和下一代有足夠的養分供應(不適用于養分脅迫研究),每代植物都必須使用足夠的肥料(Hoagland或MS液體培養基)。2) 如果巴氏殺菌或高壓滅菌減弱了PSF效應，則表明該效應是由微生物而非營養物質引起的。

●  利用SynCom將微生物群變化與植物表型聯系起來

SynCom提供了強大且可控的體系并將微生物群變化與宿主表型聯系起來(圖2c)。通常， 約30-200個分離的微生物可以被用來組裝人工SynCom(分類組成與自然土壤群落相似)。研究發現，一個免疫受損的擬南芥突變體具有葉片內生菌群失調和壞死表型，將該突變體葉片的52個分離細菌組成的群落接種到無菌環境生長的野生型擬南芥時，植株表現出壞死和發育遲緩相關表型。這證明了植物微生物菌群失調會導致植株壞死，更重要的是，人工SynCom使研究者可靈活地選擇感興趣的菌株并進行功能測試。近期一項研究，根據不同環境干擾下的共生模式將根際微生物株系分為四個模塊，并測試解構(剔除不同的模塊和關鍵菌株)的SynComs對根系生長的影響，且進一步驗證了單一細菌菌株的功能特征，如貪噬菌屬(Variovorax)可以對抗不同菌株誘導的根系生長抑制。這增強了簡化的人工SynCom解構在揭示微生物群對宿主性狀的影響方面的說服力。

●  與群落功能相關的關鍵菌株的數學預測

在進行SynCom的移植試驗時，很難設計出完美的菌株組合并最好地模擬原始微生物組的功能。目前一些機器學習方法(支持向量機，隨機森林，邏輯回歸等)被有效應用于預測不同土壤群落背景下的疾病發生率，以及基于關鍵菌株組成的數學模型預測水稻微生物組的成熟度。這表明可以通過數學方法，或基于關鍵菌株(OTU)預測土壤中感興趣的相關生物學功能變化。例如，有研究根據遮蔭下突變體能否阻斷微生物群誘導的生長促進作用進行突變體分組，從中鑒定到的37個菌株足以預測在不同突變體中是否會產生目標表型。這個結果進一步證實了菌群變化在遮蔭下促進生長的作用，并為構建不含有37個菌株的SynCom提供了依據，也將遮蔭誘導的微生物群變化與植物生長促進表型聯系在了一起。

總   結  

植物的“呼救”假說起初源于這樣一個現象：植物單作和病害會誘導微生物群的變化，并產生抑病土壤。然而，越來越多的研究鑒定了參與重塑微生物群以克服非生物脅迫(尤其是營養饑餓和不利的光照條件)的相關遺傳因子，這表明植物“呼救”機制也存在于對非生物脅迫的反應中。植物可以在時間(脅迫發生時)和空間上(如協調地上光脅迫和地下微生物群變化)重塑微生物群組成，以應對環境干擾。這些結果突出了微生物群落動態在植物環境適應中的精確調節的重要性，且僅僅依靠“有益微生物”的接種可能不足以幫助植物抵抗復雜土壤中的多種脅迫。因此，進一步了解宿主植物和微生物群之間相互作用的遺傳和生化機制(尤其是非適宜條件下)將為未來精準設計能適時招募特定有益微生物群落的作物鋪平道路。