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影響因子：12.4 研究概述：胃癌的發病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第五和第四（2002年數據），當前主要的治療是手術結合放化療，輔以靶向治療，但總體療效令人不甚滿意。因此需要深入探索影響療效的關鍵分子以及進一步開發新療法。近些年腫瘤免疫微環境（TME）被認為與腫瘤發生發展有密切聯系，腫瘤巨噬細胞，腫瘤相關成纖維細胞，PD-1/PD-L1通路，MSI-H狀態等對TME的影響相繼被報道，但仍沒有準確的預測指標來根據腫瘤免疫浸潤情況挑選出最有可能從免疫治療中獲益的患者，因此需要分析腫瘤免疫微環境的異質性。組蛋白去乙?；易澹℉DACs）在染色體結構修飾和基因表達兩個重要生物學過程中具有重要作用，其中HDAC6，HDAC3等成員以及HDAC抑制劑已被報道能夠調節TME以及免疫治療應答過程中的關鍵分子與通路，因此單個分子或者單一酶抑制劑難以精準調控TME，需要系統分析HDACs家族的表達譜以及相關的免疫浸潤情況從而為胃癌患者療法選擇以及預后評估提供理論基礎。在本研究中，作者從HDACs家族的18個成員的bulk轉錄組出發，聯合4個GEO以及TCGA和ACRG胃癌隊列進行了多組學的探索，接著進行了兩次分型并從中獲取差異基因后構建出HCS。隨后，基于HCS，作者用自己的配對bulk轉錄組和單細胞轉錄組數據進行了降維聚類、細胞通訊兩個大模塊的分析，發現關鍵細胞群后進一步對這些細胞簇進行更細分的聚類與細胞通訊分析并得出關鍵結論。隨后，作者進行了藥物敏感性分析，分析結果指向GPX4可能是低HCS患者的重要靶點并對此進行了大篇幅的實驗驗證?？傊?，這篇文章做到了bulk和單細胞的五五開，做到了生信和實驗五五開，工作量之大，值得學習！ 本文生信部分本質上是通過分型進行分組，對比不同組的各種差異，然后進行評分，比較分數與腫瘤微環境的關系。需要做類似的生信分析可以咨詢小編！ 研究結果： TCGA胃癌隊列的HDACs多組學景觀與基于HDACs表達譜的NMF分型
圖A展示了HDACs家族成員的胞內定位。圖B是十條腫瘤相關通路的ssGSEA評分與TCGA中HDACs（不同顏色代表不同子家族）表達量的相關性，發現即使是同一子家族的HDACs與通路的相關性方向也不一致。圖C是ssGSEA算法評估的不同免疫細胞浸潤水平與TCGA中HDACs表達量的相關性，可見如未成熟DC細胞的浸潤水平與HDACs表達量普遍負相關。圖D展示了基于HDACs表達譜的三個NMF亞型與胃癌患者的生存密切相關。圖E是整合了GEO中不同胃癌隊列的KEGG富集結果熱圖，圖示的是limma包在亞型間有顯著差異的通路。圖F是亞型A和亞型C在CIBERSORT算法評估的不同免疫細胞浸潤水平的差異，發現兩個亞型在重要免疫細胞的浸潤水平上有顯著差異。 ACRG胃癌隊列中再分型并計算HDAC得分（HDS）與分層 圖A展示了ACRG隊列（作為驗證隊列）中HDACs在三個亞型間的差異表達情況，顯著的PCA分型結果以及KM曲線，初步說明基于HDACs的NMF分型具有較強的泛化能力。圖B中Venn圖展示了三個亞型兩兩間的差異表達基因取交集，之后基于交集基因同樣進行NMF分型，熱圖結合臨床信息對其可視化，獲取HDAC特征A基因集和B基因集，分別是單因素COX回歸鑒定的保護基因和危險基因。圖C兩張柱狀圖是對基因集A和B的GO富集通路，發現兩群基因截然不同。圖D的?；鶊D說明基于HDACs的聚類和基于交集基因的聚類具有很高的一致性，也說明了潛在的生物學機制一致性。圖E的KM曲線說明基于差異基因的分型能夠準確預測患者生存，圖F和G發現兩種分型中各亞型的HDS（基于兩兩亞型差異分析，單因素COX回歸，Boruta算法降維，主成分分析計算而來）具有顯著的統計學差異。這部分基于自己驗證隊列的多分型分析說明HDACs家族的表達譜能夠定義胃癌患者不同的生物學狀態，并基于此計算出了HDS并將患者分為高低HDS組。
關聯HDS與臨床特征和多組學特征 圖A說明TCGA隊列中高低HDS分組能夠鑒別患者不同生存狀態，腫瘤分級以及微衛星不穩定狀態。圖B和C將ACRG隊列的HDS與各種臨床信息相關聯，在給出隊列基線信息的同時說明了HDS具有的強大預測能力，圖D分別是基于OS和RFS的單因素和多因素cox回歸，發現HDS是穩健的保護因素。圖F是不同胃癌隊列中HDS與抗原提呈相關基因，共刺激分子以及共抑制分子之間的相關性，發現相關性普遍較強并且分子與HDS的相關性在不同隊列中具有很高的一致性。
高HDS可能指向胃癌的“熱腫瘤”表型 圖A氣泡圖展示了不同免疫細胞浸潤水平與HDS的相關性，發現HDS與免疫殺傷細胞如CD4+, CD8+ T細胞，NKT細胞，Th17細胞呈現一致的正相關，與免疫抑制細胞如M2, MDSC，pDC以及基質細胞等。圖B熱圖說明HDS與血管生成基因普遍負相關，即高HDS患者血管生成不活躍。公共隊列的結果表明HDS得分越高抗腫瘤免疫越強，作者進一步用自測的121名胃癌患者隊列PKUPH驗證這一初步推論，圖D先說明HDS能夠預測PKUPH隊列患者的生存，圖E相關性熱圖一方面說明不同免疫細胞浸潤程度之間存在相關性，另一方面與HDS的相關性與在公共隊列中的發現基本一致。圖F免疫熒光發現高HDS腫瘤樣本的CD8與PD-L1表達水平明顯高于低HDS腫瘤樣本，這與前面的分析結果完全一致。
HDS能夠準確預測胃癌患者免疫治療療效 圖A是使用TIDE算法基于表達矩陣鑒別出responder和non-responder之后，用submap衡量反應分組與HDS分組的異質性，發現有統計學差異，即HDS可預測抗PD1治療反應。圖B是PRJEB40416免疫治療隊列反應分組與HDS及風險分組的關聯，但兩組之間的HDS得分沒有顯著的統計學差異。圖C是HDS和CPS以及兩者聯合預測PRJEB40416隊列免疫治療反應的ROC曲線，兩者聯合預測準確率能夠達到0.881，高于單獨預測。圖D是HDS及其他指標在另一免疫治療隊列PRJEB25780的預測情況，可以發現HDS聯合MSI聯合CPS能夠達到0.96的預測準確性。圖E展示了PRJEB25780中各反應表型的HDS評分，結果同樣與上述分析一致。圖G為預測免疫治療反應構建了諾莫圖，可用于預測免疫治療反應。
單細胞轉錄組測序探索高低HDS患者的TME特征 這部分開始轉向單細胞轉錄組的分析，這篇文章亮點之一是使用了自己的bulk轉錄組和單細胞轉錄組的配對測序結果，使得深入探索高低HDS組之間的差異成為可能。圖A是配對測序的示意圖，圖B是20個樣本的tSNE聚類圖，發現了9個細胞群并用熱圖展示了各細胞群的marker基因。圖C展示的是20個配對樣本每個患者基于bulk轉錄組計算的HDS以及風險分組，兩個tSNE聚類圖分別展示了高HDS組和低HDS組的細胞群分布，圖D用柱狀圖量化了9個細胞簇中高低HDS兩組的比例，發現兩組患者的TME浸潤程度有較大差別。圖E是對圖D進行的兩組檢驗，發現有統計學差異的正是關鍵的CD4+T細胞，CD8+T細胞以及NK細胞，這些殺傷細胞在高HDS組中比例更高。圖F在表達層面上用免疫熒光驗證了高HDS腫瘤組織中CD4以及CD8熒光信號比低HDS腫瘤組織更強。
內皮細胞和纖維母細胞可能通過MIF信號通路抑制T細胞和NK細胞浸潤 圖A展示兩組細胞通訊的交互數量以及交互強度，發現低HDS組有更高的交互強度，圖B環形圖與熱圖同樣說明低HDS組的細胞間具有更強的交互并且具體到時內皮細胞和成纖維細胞與CD4+T，CD8+T細胞以及NK細胞之間通信強度高。接下來又將這兩種細胞在高低HDS組中做了tSNE降維聚類，圖C表示鑒定出2個內皮細胞群和6個成纖維細胞群及其marker基因，并基于marker基因對細胞群進行命名。圖D與圖A基本平行，柱狀圖展示了每個細胞群中高低HDS來源細胞的比例。因為關注的是能夠殺傷腫瘤細胞的CD4+T，CD8+T細胞以及NK細胞，所以對這三類細胞進一步進行了降維聚類，鑒定出22個細胞群后與內皮細胞和成纖維細胞的8個細胞群進行細胞通訊，挑選出與三類細胞通信數量及強度均最高的SFRP2+, MYH11+, CD69+成纖維細胞，CD234+內皮細胞。圖F氣泡圖是對這個亞群和T細胞及NK細胞之間通訊涉及到的通路的探索，發現MIF信號通路在低HDS組中顯著富集，作者推斷挑選出來的3個成纖維細胞群和一個內皮細胞群可能通過MIF信號與三種效應細胞溝通，從而降低了它們在低HCS樣本中的浸潤水平。
低HDS組患者中CCL17陽性漿細胞樣樹突狀細胞可能通過MIF信號通路抑制T細胞和NK細胞浸潤 除了上一張圖B中關注的內皮細胞和成纖維細胞，髓系細胞與T細胞核NK細胞的溝通也較強，于是作者進一步將髓系細胞劃分為12個細胞群（圖A）并根據標記基因對細胞類型進行注釋（圖B），圖C氣泡圖展示了每個細胞群的TOP5 marker基因。圖D是兩組患者各自12群髓系細胞與T細胞以及NK細胞的通訊情況，發現以CCL17+為標記基因之一的pDC細胞在高低HCS組中均與T細胞和NK細胞有較強的通訊。隨后，與上一張圖F思路一致，圖E發現CCL17+pDC細胞與T細胞和NK細胞之間的通訊同樣設計MIF通路。圖F探究MIF信號通路關鍵受體在上述細胞及高低HCS組中的表達差異，但結果是陰性的。得到CCL17+pDC細胞群后，作者對這一群細胞進行了KEGG通路富集，發現其功能主要富集在T細胞分化以及抗原提呈等經典抗腫瘤免疫通路中（圖G），ACRG隊列中CCL17+pDC細胞的富集得分與HDS負相關（圖H），但不能對生存分層（圖I）?；谝陨戏治觯髡咛岢觯涸诘虷DS腫瘤中，CCL17+pDC可能通過激活MIF通路與T細胞和NK細胞頻繁交流從而阻斷后者的浸潤水平。
在低HDS患者中GPX4可能是腫瘤細胞的重要靶點 圖A展示了MIF通路4-IPP抑制劑的用法，圖B體外實驗說明抑制MIF通路能夠減小腫瘤體積，圖C說明抑制MIF通路后CD8+和CD4+T細胞數量上升，圖D-G流式分析結果表明抑制MIF通路后細胞毒性CD8+T細胞以及CD8+T細胞數量上升。
接下來做了藥物敏感性分析，圖A是藥敏分析的流程圖，用的是CTRP2和PRISM的藥敏信息以及CCLE的表達信息，主要篩選條件是高低HCS組間AUC有差異以及AUC與HCS的相關性。圖B1在CTRP2數據庫中發現低HCS胃癌細胞系可能對三種GPX抑制劑敏感，圖B2在PRISM數據庫中發現低HCS胃癌細胞系可能對兩種藥物敏感。為進一步探究GPX4抑制劑對低HDS腫瘤患者敏感的機制，作者在CCLE數據庫中選取了5個胃癌細胞系（圖B3），計算其HDS后發現AGS細胞系的HDS最低，因此選取AGS細胞系用不同siRNA沉默GPX4，選取沉默作用最強的siGPX4-2進行后續實驗（圖B4）。為進一步探究GPX4抑制劑對高HDS患者的高敏感機制，作者在ACRG和TCGA隊列中探索18種HDACs的表達，發現絕大多數HDASs在兩組間差異表達（圖C），隨后作者敲除GPX4驗證了公共數據庫發現的HDACs差異（圖D），敲除后通路富集在代謝和免疫（圖E），在沉默GPX4后，作者還發現敲除GPX4后共刺激與共抑制分子的表達發生了變化（圖F）。最后，作者在ACRG隊列中基于GPX4表達分組發現免疫浸潤及細胞因子表達有顯著差異（圖G）。
GPX4敲除可能促進CD8+T細胞浸潤并提升抗PD-L1療效 這部分用MFC胃癌細胞系探索沉默GPX4后對腫瘤表型的影響。圖A的RT-PCR結果以及WB結果表明成功沉默了GPX4表達，且沉默組發生了更多的腫瘤細胞調往（圖B）。圖C的遷移侵襲實驗說明沉默GPX4能夠降低胃癌細胞的遷移侵襲能力，，圖D的Edu實驗發現沉默GPX4能夠降低腫瘤細胞增殖率，圖E的小鼠皮下異種移植模型說明沉默GPX4能夠減少腫瘤體積并與更高的存活率有關。
接下來作者繼續探索沉默GPX4對免疫細胞浸潤的影響。沉默GPX4后，CD8+細胞水平降低（圖A），CD8+T細胞水平上升（圖B），CD8+T細胞分泌的IFN-γ增加（圖C）。圖D示意將小鼠脾臟T細胞與腫瘤細胞共培養，發現與對照組相比，與沉默GPX4的腫瘤細胞系MFC共培養的CD8+T細胞毒性更強（圖E）。隨后作者進一步探索了沉默GPX4所致CD8+T細胞增強的機制，發現沉默GPX4后PD-L1的mRNA和蛋白水平都顯著下降（圖F），沉默組小鼠皮下腫瘤移植物的PD-L1 mRNA表達也要高于未沉默組（圖G）。最后，作者發現敲除GPX4與抗PD-L1聯合治療可提高胃癌免疫治療效果（圖H）。
研究總結： 這篇文章根據胃癌 HDAC 的表達特征構建了一個 HDS 模型，該模型用于評估TME特征和預測免疫療法療效，可以準確反映胃癌的亞型特征，并為胃癌的 TME 提供定量指標。高 HDS 表示腫瘤 "熱"，可從免疫療法中獲益。抑制TME中的MIF信號通路和腫瘤細胞中GPX4的表達可能是胃癌冷腫瘤協同免疫療法的重要策略。 |
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