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基于透明化包埋技術的 外周神經連接圖譜成像  本期青科沙龍關鍵詞 TESOS技術 透明化包埋 投射重建 fMOST技術  生物醫學成像正在由二維走向三維。獲取完整的生物組織介觀尺度三維結構信息是生命科學基礎研究的重要目標。然而，組織的不透明性極大地阻礙了光學成像的深度。為什么生物物質看起來是不透明的呢？首要原因是光的散射。生物組織中含有水、脂肪、蛋白質、礦物質等多種成分，其不均勻分布會導致光發生強烈的散射，使光無法直接穿過組織。另一方面，機體內的血紅蛋白、黑色素等物質可吸收光，限制光線通過。為了解決上述兩個問題，組織透明化技術由此誕生。一方面，通過脫色技術減少光的吸收，另一方面，利用含有高折射率介質的透明液取代樣本中水分和脂質，平衡組織折射率，減少光的散射，從而使組織實現光學透明。 一個常見生活現象可以很好地幫助我們理解組織透明化技術的原理。當我們把一整塊透明的冰砸碎后，冰渣是不透明的白色。因為里面的水、冰、空氣三種組分折射率差異巨大。接著我們把碎冰放入水中，冰渣會立刻變回透明。組織透明化技術的過程其實與此過程原理完全一致。
2024年1月3日，北京腦科學與類腦研究所趙瑚教授團隊于Cell Research發表封面文章Mapping of individual sensory nerve axons from digits to spinal cord with the transparent embedding solvent system，報道了這一新技術及其應用。 1 研究過程  接著，研究團隊設計了一套放置樣本的Magmount裝置。該裝置用于將透明化包埋樣本放置于顯微鏡載物臺，同時實現樣本的靈活轉移和精確復位。有了透明化包埋樣本 Magmount裝置 石蠟切片機，TESOS技術可以與市面上幾乎所有商用正置共聚焦/雙光子/光片顯微鏡體系（Leica, Nikon, Olympus, Zeiss, 3i等等）結合，實現任意組織類型大樣本高分辨成像。無需單獨開發專用成像系統，也無需對顯微鏡本身做改動。這種高度的靈活性是TESOS技術的一個巨大優勢。與傳統切片成像體系比如fMOST，ViSoR 或者Mouselight相比，TESOS大大降低了神經連接圖譜成像這一高大上技術的實現成本。 透明化包埋后的樣本拍攝過程簡單明了。樣本粘結于Magmount裝置，一起固定于載物臺上，用選定鏡頭像拍切片一樣對樣本表面三維圖像塊進行深度成像。拍攝深度取決于鏡頭工作距離以及對分辨率的需求。拍完表淺區塊后，將樣本轉移至石蠟切片機切削掉成像過的區域（或使用電機磨削），然后再轉移回顯微鏡拍攝下一個三維圖像塊。最后基于圖像塊之間的重疊區域拼接為完整的大三維圖像塊。比如說，我們可以使用最常用于拍攝切片的高分辨率40×/1.3NA 油鏡 （工作距離240微米）拍攝樣本表面大概350微米厚度的樣本（TESOS樣本無需蓋玻片，從而可以拓展170微米的工作距離），然后切片機切削去約300微米厚度，接著拍攝下一個350微米厚度組織塊。最后通過約50微米的重疊區將上下兩個圖像塊拼接成為一個650微米厚度連續圖像塊。重復上述操作，就可使用高分辨率短工作距離鏡頭拍攝任意大小樣本。小型的圖像數據拼接（小于100GB）可以用Image J實現。團隊自己也編寫了TESOS-Stitcher軟件用于更大規模圖像數據的拼接。   TESOS透明化包埋后利用光片顯微鏡進行成年小鼠全身神經成像 （雙通道拍攝，樣本總體積100×35×20mm3，總拍攝時長120小時，原始數據量約70TB） 與光片顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡具有更高的成像分辨率、更好的成像效果，高倍鏡下能夠獲得更多的生物學細節。團隊進一步利用TESOS透明化包埋結合徠卡共聚焦顯微鏡20×/0.95NA鏡頭成像，對新生小鼠全身的神經分布進行了亞微米級分辨率的重建。 大樣本的高質量高分辨率成像是神經投射研究的重要挑戰之一。團隊充分發揮TESOS透明化包埋的技術優勢，利用共聚焦顯微鏡40×/1.3NA鏡頭，先后完成了小鼠大腦皮層一個1.5毫米厚度腦組織塊的亞微米級分辨率成像、包含肌肉和椎骨的小鼠背根神經節及相應的脊髓內感覺神經亞微米級分辨率成像（、以小鼠前爪為代表的單軸突分辨率外周神經組織成像，并通過病毒標記的手段完成了支配小鼠前爪肉墊的其中12個感覺神經元在脊髓內投射的重建及分析。 最后的終極技術挑戰是感覺神經元的全貌重建。一個感覺神經元其外周末梢可以遠在指尖，連接的傳入神經纖維穿行于各類復雜軟硬組織，將承載著感覺信號的電刺激傳遞到位于脊髓背根神經節的胞體，然后再通過中樞分支投射到脊髓內部。正是由于這樣復雜而長的組織結構，哺乳動物的單個感覺神經的全貌從來沒有被完整重建。 團隊利用成體Thy1-EGFP小鼠，進行了皮膚上的感覺神經末梢到背根神經節再到脊髓的跟蹤拍攝，繪制了5個神經元的完整投射行程，實現了單個神經元從外周到中樞投射重建的技術突破。 2 研究結論 TESOS是對傳統組織透明化及三維成像技術的一種理念革新。其核心概念在于“透明”和“包埋”。“透明”是TESOS與基于超薄切片的大尺度三維成像技術（以fMOST為代表）的最大區別。聚合后的良好透明度保證了成像質量，也使得TESOS技術與包含光片顯微鏡、共聚焦顯微鏡等多種成像系統的有機結合成為可能。TESOS包埋形成的有機樹脂與其他水性透明化技術中的瓊脂糖包埋凝膠截然不同，其良好的機械硬度及切割性能大大提高了操作的穩定性，切削（磨削）后樣品變形小，數據拼接及重建具有良好的準確性。這一特性使得TESOS相較于ViSoR2（目前多用于大腦樣品處理）有更廣泛的適用范圍，能夠同時適用于中樞及外周的處理與成像。 原文鏈接 Mapping of individual sensory nerve axons from digits to spinal cord with the transparent embedding solvent system | Cell Research (nature.com) 直  四川大學華西口腔醫學院伊亞婷博士、張士文博士、門乙博士、北京腦科學與類腦研究所博士生研究生李有淇為論文的共同第一作者，北京腦科學與類腦研究所趙瑚教授、戈鵡平教授、曲靖醫科大學何永文教授為論文的共同通訊作者。 神經成像的相關研究一直是科研的熱門方向，在調研了一線科研工作者的需求后，我們聯系并邀請到了本文通訊作者：北京腦科學與類腦研究中心高級研究員——趙瑚對本項研究進行分享。 1 講者信息 北京腦科學與類腦研究中心高級研究員——趙瑚 2 主辦平臺 華安生物、深究科學、生物世界 3 直播時間 2024年3月12日 20:00-21:00 |
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