【原】微生態(tài)研究新熱潮：擴(kuò)增子絕對(duì)定量（一）

凌恩生物 2024-10-11

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一、微生態(tài)研究現(xiàn)狀

微生態(tài)研究的快速發(fā)展提高了人們對(duì)微生物群落的理解。然而，目前大多數(shù)微生態(tài)研究仍依賴于相對(duì)定量的方法，這種方法往往不能準(zhǔn)確反映環(huán)境中微生物群落的真實(shí)情況。相對(duì)定量只關(guān)注微生物的相對(duì)豐度，而忽視了其絕對(duì)豐度的變化，可能導(dǎo)致對(duì)微生物生態(tài)功能的誤判。

例如有兩個(gè)群落，一個(gè)隨著時(shí)間的推移逐漸繁盛，另一個(gè)逐漸消亡，但相對(duì)定量顯示為相同的結(jié)論。相對(duì)豐度數(shù)據(jù)的組成性質(zhì)因此可能掩蓋群落動(dòng)態(tài)，無(wú)法真實(shí)還原群落的繁盛和消亡。絕對(duì)定量能夠更真實(shí)還原微生物的群落動(dòng)態(tài)變化。

圖1 絕對(duì)定量能夠更真實(shí)還原微生物的群落動(dòng)態(tài)變化[1]

二、微生物絕對(duì)定量

目前應(yīng)用最廣泛的基于細(xì)胞和基于分子的微生物絕對(duì)定量方法，包括Spike-in內(nèi)標(biāo)法、qPCR絕對(duì)定量法等。本期，小編帶大家聊一聊Spike-in內(nèi)標(biāo)法的原理和應(yīng)用吧！

1、項(xiàng)目介紹：Spike-in內(nèi)標(biāo)法

2016年，F(xiàn)rank St?mmler等人在Microbiome發(fā)表題為“Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in Bacteria”[2]的研究論文，研究者提出建議將外源細(xì)菌spike-in制備成標(biāo)準(zhǔn)品，以量化絕對(duì)細(xì)菌豐度的比例，并命名為 spike-in-based calibration to total microbial load (SCML)。研究者使用含有確定數(shù)量的spike-in細(xì)菌Salinibacter ruber，Rhizobium Radiobter和Alcylobacillusacdiphus，通過(guò)這些spike-in細(xì)菌的16S rDNA reads計(jì)數(shù)來(lái)調(diào)整內(nèi)源性細(xì)菌的read計(jì)數(shù)，以分析總微生物載量的變化，結(jié)果表明腸道微生物組研究中的外源性spike-in細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品可以估計(jì)絕對(duì)OTU豐度的比例，為腸道微生物組的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)提供新的見(jiàn)解。

圖2 Spike-in 分析流程圖

2、Spike-in內(nèi)標(biāo)法原理介紹

2020年，中科院分子植物卓越中心王二濤研究組在Science Bulletin發(fā)表研究論文“An amplification-selection model for quantified rhizosphere microbiota assembly”[3]，基于spike-in絕對(duì)定量結(jié)果，提出根際微生物群落“擴(kuò)增-選擇”組裝新模型。

基于微生物相對(duì)豐度測(cè)序數(shù)據(jù)，研究人員提出了根際微生物群落的兩步或多步篩選組裝模型（圖1A），該模型認(rèn)為：微生物在根外土（bulk soil）、根際土 (rhizosphere soil) 和根內(nèi) (root) 逐步被篩選，最終形成植物根際特異的微生物群落。但是，基于微生物相對(duì)豐度，忽略了單位質(zhì)量或體積中微生物群落的絕對(duì)豐度，以及不同菌株16s拷貝數(shù)差異，得出的結(jié)論往往不足以讓人信服！為了克服常規(guī)16S rRNA基因高通量測(cè)序相對(duì)定量研究的局限性，作者采用了以下組合方法：

1、首先向根際樣本中添加了已知濃度的人工合成的spike-in質(zhì)粒（spike-in質(zhì)粒包含隨機(jī)排列的堿基序列，隨機(jī)序列兩端是16S rRNA基因測(cè)序的正反向引物對(duì)應(yīng)序列，隨機(jī)序列長(zhǎng)度及堿基GC含量與16S rRNA基因測(cè)序片段一致），用來(lái)定量檢測(cè)單位質(zhì)量根際樣本中細(xì)菌16S rRNA基因的總量（quantified 16S abundance）；

2、進(jìn)一步通過(guò)rrnDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了每種細(xì)菌可操作分類單元（Operational Taxonomic Units,OTU）的16S rRNA基因平均拷貝數(shù)，然后通過(guò)加權(quán)平均獲得了每種細(xì)菌OTU的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)目（quantified bacterial abundance）；但是須知，該網(wǎng)站只適合16S數(shù)據(jù)，且該網(wǎng)站基于Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄的16S數(shù)量相對(duì)較少，從而影響物種定量；

3、通過(guò)對(duì)單拷貝的rpoB基因測(cè)序，比較并評(píng)估基于16S rRNA基因定量測(cè)序計(jì)算出的絕對(duì)細(xì)菌數(shù)目的準(zhǔn)確性。

圖3 評(píng)估根際微生物絕對(duì)定量的組合方法

通過(guò)Spike-in絕對(duì)定量，研究者發(fā)現(xiàn)，16s基因含量在根外土、根際土和根內(nèi)的絕對(duì)豐度分別為：1.1 × 109，1.51 × 1010和3.28 × 109，根際土中細(xì)菌16S rRNA基因的含量是根外土的13.7倍。再通過(guò)16S rRNA基因的拷貝數(shù)加權(quán)后，得到細(xì)菌在根外土、根際土和根內(nèi)絕對(duì)豐度分別為：6.91 × 108，6.44 × 109和1.24 × 109，根際土中細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目是根外土的9.3倍?；诖私Y(jié)果，研究者重新提出了根際微生物群落組裝模型—“擴(kuò)增-選擇”（圖1B），該模型認(rèn)為根外土中的微生物經(jīng)根際土擴(kuò)增后被根篩選，從而形成特異的根內(nèi)微生物群落。“擴(kuò)增-選擇”新模型，將指導(dǎo)人們定量追蹤植物根際微生物群在不同時(shí)期絕對(duì)豐度的變化，有助于將根際微生物與植物性狀關(guān)聯(lián)分析，提升根際微生物在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用。

圖4根際微生物群落組裝模型 A：兩步或多步篩選組裝模型 B：擴(kuò)增-選擇模型

三、凌恩生物微生物絕對(duì)定量解決方案

凌恩生物微生物絕對(duì)定量技術(shù)運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)和spike-in內(nèi)標(biāo)法實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物（16s/ITS/18S）的絕對(duì)定量。通過(guò)在樣品中加入已知拷貝數(shù)的spike-in內(nèi)參序列，與樣品同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增、建庫(kù)測(cè)序，然后通過(guò)內(nèi)參的理論拷貝數(shù)與測(cè)序tags數(shù)，根據(jù)王二濤老師文章[2]獲得標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算公式，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算公式及相當(dāng)定量結(jié)果計(jì)算得到OTUs/ASVs的絕對(duì)拷貝數(shù)表，能夠一次獲得所有細(xì)菌的絕對(duì)定量結(jié)果。詳情可查閱往期推文（Spike-in：微生態(tài)16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量重磅上線！）