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提要 DNA結合蛋白的化學合成、結構與功能研究有助于闡明基因調控過程的分子機制。主要介紹反相高效液相色譜法(RP-HPLC)在化學合成DNA結合肽分析純化中的應用。 關鍵詞 反相高效液相色譜法，合成肽 1 前言自從Merrifield發明固相法化學合成多肽以來，有關各種活性多肽及蛋白質的化學合成有了很大的發展)。但是，最終產物的成分往往比較復雜，不經純化很難得到高純度的目標肽，這是目前用固相法合成肽的主要問題之一。近年來已出現了多種多肽及蛋白質的分離純化技術。反相高效液相色譜法(RP-HPLC)是目前分析純化多肽及蛋白質的主要手段“。前文[5]對結構與功能的研究是為了搞清楚基因調控的分子機制。本文主要介紹RP-HPLC在化學合成DNA結合肽分析純化中的應用。 2 實驗部分2.1 儀器及雜件 715高效液相色譜系統(法Gilson公司),600E高效液相色譜儀(美Waters公司),820高效液相色譜系統(Waters公司)。色譜柱：Cosmosil 5C-C AR(10×250mm),YMC-gel ODS(20×250mm)。檢測波長：214nm,流動相：A為0.1%TFA-H?O,B為0.1%TFA-CH?CN。 2.2 固相多肽的合成 90型自動多肽合成儀(美Advanced Chemtech公司),對稱酐法接肽；430A型自動多肽合成儀(美ABI公司),DCC/HOBt法接肽。溶劑為NMP/DMF,MBHA樹脂(取代值為0.5mmol/g),采用帶有側鏈保護的各種tBoc-氨基酸，Kaiser法檢測反應終點。無水氯化氫脫除側鏈保護基得粗品肽。 3 結果與討論我們合成了具有“亮氨酸拉鏈”結構的酵母轉錄活化因子GCN-4(No.1)具有“螺旋-轉折-螺旋”結構的癌基因產物C-myb蛋白(No.2)及具有“鋅指”結構的花椰菜花葉病毒內鋅指多肽(No.3),其氨基酸序列為： No.1:DPAALKRARNTEAARRSRARKLQRMKQGGC No.2:Troc-TDDWKVIANYLPNRTDVQCQHRWQKVLNPE No.3:CRCWICNIEGHYANECP-NH? 3.1 合成多肽的RP-HPLC分析 多肽的RP-HPLC主要采用C色譜柱，流動相A為0.1%TFA-H?O,流動相B為0.1%TFA-CH?CN,我們在多肽分析及制備時所采用的較典型的洗脫條件見圖1。  親水和疏水比例相當的約含30個氨基酸殘基以下的多肽，其洗脫部分一般從20%開始，按增加0.01mL/min的梯度洗脫，圖2是No.3的RP-HPLC分析圖。多肽的結構中疏水氨基酸比例增加時，洗脫的起始部分(或稱平衡梯度)也相應增加，反之則降低。在通常情況下，平衡梯度隨分析肽鏈的增大而增加。  3.2 多肽的雙波長分析 對于含芳香氨基酸(如Phe,Tyr及Trp)的多肽，可用119檢測器同時進行雙波長(例如214nm檢測肽鍵，254nm檢測芳環)檢測，并利用715軟件進行雙波長比較，也可對特定峰進行紫外可見波長掃描，以幫助鑒定各色譜峰，從而為其它分析方法提供結構信息及減少樣品數量(圖3)。  3.3 多肽非對映異構體的分析 為了研究硫酯縮合反應中可能發生的消旋化反應，我們應用RP-HPLC成功地分離了Boc-Ala-(D/L)Ala-Gly-OBzl非對映異構體(見圖4),并利用模型體系研究了硫酯縮合反應在各種條件下的消旋化，找到了降低消旋化的反應條件，該方法具有快速、簡便的特點。  3.4 對反應過程的監測分析 利用RP-HPLC可以有效地監測多肽的各種反應。圖5是對No.1樣品進行—SH氧化為二硫鍵的RP-HPLC監測結果。由于RP-HPLC的分辨率較高，多肽側鏈的化學修飾可以用RP-HPLC進行分析監測。在進行硫酯縮合法合成C-myb蛋白時，需對No.2樣品5位及25位的Lys側鏈氨基進行選擇性Boc保護。RP-HPLC跟蹤分析結果示于圖6。峰a是No.2原料峰，反應10min后出現峰b,c和d.峰b和c是單Boc保護峰，峰d是雙Boc保護的產品峰。   3.5多肽的制備性純化 多肽的質譜分析、氨基酸組成分析、各種光譜分析、生化分析、2DNMR結構測定及活性測定等常需幾毫克或數十毫克的純樣品。我們在進行有關多肽的半制備及制備性純化時，分別利用Cosmosil 5C-Ci(10×250mm)及YMC-gelODS(20×250mm)兩種色譜柱，色譜條件基本以分析時的色譜條件為基礎。在進行No.2樣品的制備性純化時(見圖7),應用YMC-gel ODS(20×250mm)色譜柱，流速7mL/min,每次粗品多肽的進樣量達30～40mg.經8次重復性制備，得色譜純樣品85mg,用于硫酯片段縮合法合成C-myb蛋白[9]。  4 結論RP-HPLC是目前多肽及蛋白質的主要分析純化手段，我們應用RP-HPLC有效地分析純化了所合成的各種DNA結合肽。結果表明，RP-HPLC具有分辨率高、快速簡便、重復性好等優點。 免責聲明：本文為行業交流學習，版權歸 原作者所有，如有侵權，可聯系刪除。 |
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