|
測定合成群落中的細菌群落組成是理解微生物系統的關鍵。以往的方法（細菌培養或基于PCR）費時費力、昂貴或容易產生偏倚，流式細胞術被認為是一種廉價且快速的替代方法。然而，由于該技術捕捉了細菌細胞的表型狀態，當細菌共培養時，群落組成的準確測定會受到影響。本研究通過模型菌群，以qPCR、擴增子測序為對照，檢測了流式細胞評估群落組成的能力。 一.實驗設計 1.培養準備 ● 無菌培養：準備單個細菌菌株的純培養，以建立基線測量； ● 模擬群落：通過混合已知比例的不同菌株后生長構建，以模擬群落相互作用.（Mock1-7：均勻混合的群落，Mock8-9：不均勻混合的群落）； ● 共培養：在控制條件下共同培養細菌，以觀察相互作用和群落組成的變化。 2.測量技術 ● 流式細胞術：用于根據表型特征量化細菌種群，隨機森林分類器在無菌培養的流式細胞術數據上訓練，以預測混合樣本中的群落組成。 ● 特定菌株qPCR：作為比較方法，用于量化群落中的特定菌株。 ● 16S rRNA擴增測序：用于更廣泛地分析群落結構，提供不同分類群的多樣性和相對豐度。
二.主要研究結果 對于均勻的微生物群落（Mock1-7），與菌株特異性qPCR和16S rRNA基因擴增子測序相比，流式細胞術具有更低的平均均方根誤差，表現良好。 對于不均勻的模擬群落（Mock8-9），PCR方法的均方根誤差（RMSE）低于流式細胞術。在由一種菌株主導的模擬群落中，因為分析的大部分遺傳物質將來自這一菌株，PCR方法的局限性變得不那么明顯。相比之下，流式細胞術在高度不均勻的模擬社區中產生更高的RMSE。16S rRNA基因擴增子測序的RMSE較菌株特異性qPCR更低，因此對群落組成的判斷更準確。 共培養時，流式細胞術、菌株特異性qPCR和16S rRNA基因擴增子測序均未發現相似的菌群組成。與模擬群落相比，由于表型的變化，流式細胞術的性能下降。發現基于流式細胞術的隨機森林分類器中包含的菌株越多，分類器的準確率越低。凸顯了通過流式細胞術定量共培養中的群落組成所面臨的挑戰。
三.思考與討論 流式細胞術在確定體外模擬均勻群落的組成方面優于PCR方法，但在確定不均勻群落、共培養群落的組成方面，流式細胞術的性能有所下降。對模擬群落進行的絕對定量分析表明，流式細胞術和菌株特異性qPCR之間的總細胞濃度有很大差異，其中qPCR導致的濃度比流式細胞術高約10倍。由于大量細胞聚集被錯誤地計數為單個細胞，因此流式細胞術低估了實際細胞計數。因此，在研究不均勻群落微生物組成時，可以考慮16S rRNA+qPCR結合——16S rRNA絕對定量。 凌恩 深耕微生態研究，率先推出擴增子絕對定量產品，包括Spike-in內標法、qPCR絕對定量法，合作客戶已發表多篇擴增子絕對定量文章，凌恩 期待與你合作！
參考文獻 Quantifying synthetic bacterial community composition with flow cytometry: efficacy in mock communities and challenges in co-cultures.mSystems,2024. |
|
|
